一种生产人凝血因子Ⅷ的层析纯化工艺的制作方法

本发明涉及血液制品，具体涉及一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺。

背景技术：

1、人凝血因子ⅷ（human coagulation factor ⅷ）是人血浆中一种重要的蛋白质，是人体内源性凝血途径的主要成分，人凝血因子ⅷ对缺乏人凝血因子ⅷ所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。随着技术的日趋发展，层析技术已成熟应用于人凝血因子ⅷ的分离制备，特别是离子交换层析法，因其制备的人凝血因子ⅷ具有纯度较高，重现性好，成本相对较低的优点，为国内外大多数厂家所采用。

2、《中国药典》2015版规定人凝血因子ⅷ的比活性为每1mg蛋白质应不低于10.0iu，但人凝血因子ⅷ分子量大、结构复杂，易失活，因此规模化生产的人凝血因子ⅷ的比活性一般会比规定的高。而比活性高的人凝血因子ⅷ，在疾病治疗中发挥着巨大的作用。

3、常用的离子交换层析法纯化工艺路线为平衡-上样-洗涤-洗脱，按照该工艺路线进行试验，经单步洗涤层析工艺纯化，洗脱后人凝血因子ⅷ的效价回收率和比活性均不高，而当对常规层析工艺进行优化时，效价回收率和比活性往往存在此消彼长的问题，如果能将效价回收率和比活性同时提高，则极大降低了人凝血因子ⅷ商业化生产的难度和成本，提升血浆的综合利用率。

技术实现思路

1、针对现有技术中难以同时提高人凝血因子ⅷ效价回收率和比活性的技术问题，本发明提供一种适用于商业化规模生产人凝血因子ⅷ的层析纯化方法，得到的人凝血因子ⅷ具有比活性高、效价回收率高、工艺简单、适于商业化生产等优点。

2、本发明技术方案如下：

3、一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，步骤包括层析柱平衡、层析柱上样、层析柱洗涤和层析柱洗脱，层析柱洗涤时先后采用洗涤液a、洗涤液b进行两步梯度洗涤，洗涤液a包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠120～140mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠140～180mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00±0.50，层析柱填料为toyopearl deae-650m阴离子交换凝胶。

4、进一步的，洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠120mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。

5、进一步的，洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠130mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。

6、进一步的，洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠140mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。

7、进一步的，层析柱平衡时使用ph为7.00±0.50的平衡液。

8、进一步的，平衡液包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠80～120mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l。

9、进一步的，平衡液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠80mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，平衡液ph为7.00。

10、进一步的，s/d病毒灭活后制品调整电导率与平衡液一致后进行层析柱上样。

11、s/d病毒灭活后制品上样前调整电导率与平衡液一致可以减少上样前s/d病毒灭活后制品的电导率波动，增大人凝血因子ⅷ和杂蛋白吸附能力差异，使大多数杂蛋白无法被吸附，而人凝血因子ⅷ蛋白恰能被吸附，更有利于分离纯化。

12、进一步的，层析柱洗脱时使用ph为7.00±0.50的洗脱液，洗脱液包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠1～2mol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l。

13、进一步的，洗脱液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠1mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗脱液ph为7.00。

14、本发明的有益效果在于：

15、本发明提供的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，在常规层析技术基础上，将单步洗涤优化为两步梯度洗涤，两步梯度洗涤的氯化钠浓度分别选择在一个合适的范围内，洗涤a的氯化钠浓度低，与s/d病毒灭活后制品浓度相当，采用洗涤液a洗涤后，可有效洗涤掉一些结合不牢固的杂蛋白，而不影响人凝血因子ⅷ，采用洗涤液b洗涤后，由于氯化钠浓度的适当提高，可在人凝血因子ⅷ效价的损失较少的前提下进一步洗涤掉部分结合较为牢固的杂蛋白，既能够满足去除杂蛋白的需求，又能尽量避免人凝血因子ⅷ的损失，实现了效价回收率和比活性的同时提高，对人凝血因子ⅷ的商业化生产有非常积极的影响，且在多次平行试验中发现，本发明受凝胶批次差异的影响较小，工艺表现稳定。

技术特征：

1. 一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，步骤包括层析柱平衡、层析柱上样、层析柱洗涤和层析柱洗脱，层析柱洗涤时先后采用洗涤液a、洗涤液b进行两步梯度洗涤，洗涤液a包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠120～140mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠140～180mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00±0.50，层析柱填料为toyopearl deae-650m阴离子交换凝胶。

2.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠120mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。

3.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠130mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。

4.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠140mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。

5.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，层析柱平衡时使用ph为7.00±0.50的平衡液。

6.如权利要求5所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，平衡液包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠80～120mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l。

7.如权利要求6所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，平衡液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠80mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，平衡液ph为7.00。

8.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，s/d病毒灭活后制品调整电导率与平衡液一致后进行层析柱上样。

9.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，层析柱洗脱时使用ph为7.00±0.50的洗脱液，洗脱液包括枸橼酸钠10～20mmol/l、氯化钠1～2mol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化钙1～3mmol/l。

10.如权利要求9所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺，其特征在于，洗脱液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠1mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l，洗脱液ph为7.00。

技术总结本发明涉及血液制品技术领域，具体涉及一种生产人凝血因子Ⅷ的层析纯化工艺，步骤包括层析柱洗涤，层析柱洗涤时先后采用洗涤液A、洗涤液B进行两步梯度洗涤，洗涤液A包括枸橼酸钠10～20mmol/L、氯化钠120～140mmol/L、甘氨酸120～150mmol/L和氯化钙1～3mmol/L，洗涤液B包括枸橼酸钠10～20mmol/L、氯化钠140～180mmol/L、甘氨酸120～150mmol/L和氯化钙1～3mmol/L，洗涤液A、洗涤液B的pH均为7.00±0.50，层析柱填料为Toyopearl DEAE‑650M阴离子交换凝胶，得到的人凝血因子Ⅷ比活性高、效价回收率高。技术研发人员：孙丰斌,张兴魁,师秀梅,张国栋,王健,候绪刚,陈政,乔福锋,郑志华受保护的技术使用者：山东泰邦生物制品有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29