一种生产人凝血因子Ⅷ的层析纯化工艺的制作方法
- 国知局
- 2024-10-09 15:32:19
本发明涉及血液制品,具体涉及一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺。
背景技术:
1、人凝血因子ⅷ(human coagulation factor ⅷ)是人血浆中一种重要的蛋白质,是人体内源性凝血途径的主要成分,人凝血因子ⅷ对缺乏人凝血因子ⅷ所致的凝血机能障碍具有纠正作用,主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。随着技术的日趋发展,层析技术已成熟应用于人凝血因子ⅷ的分离制备,特别是离子交换层析法,因其制备的人凝血因子ⅷ具有纯度较高,重现性好,成本相对较低的优点,为国内外大多数厂家所采用。
2、《中国药典》2015版规定人凝血因子ⅷ的比活性为每1mg蛋白质应不低于10.0iu,但人凝血因子ⅷ分子量大、结构复杂,易失活,因此规模化生产的人凝血因子ⅷ的比活性一般会比规定的高。而比活性高的人凝血因子ⅷ,在疾病治疗中发挥着巨大的作用。
3、常用的离子交换层析法纯化工艺路线为平衡-上样-洗涤-洗脱,按照该工艺路线进行试验,经单步洗涤层析工艺纯化,洗脱后人凝血因子ⅷ的效价回收率和比活性均不高,而当对常规层析工艺进行优化时,效价回收率和比活性往往存在此消彼长的问题,如果能将效价回收率和比活性同时提高,则极大降低了人凝血因子ⅷ商业化生产的难度和成本,提升血浆的综合利用率。
技术实现思路
1、针对现有技术中难以同时提高人凝血因子ⅷ效价回收率和比活性的技术问题,本发明提供一种适用于商业化规模生产人凝血因子ⅷ的层析纯化方法,得到的人凝血因子ⅷ具有比活性高、效价回收率高、工艺简单、适于商业化生产等优点。
2、本发明技术方案如下:
3、一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,步骤包括层析柱平衡、层析柱上样、层析柱洗涤和层析柱洗脱,层析柱洗涤时先后采用洗涤液a、洗涤液b进行两步梯度洗涤,洗涤液a包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠120~140mmol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠140~180mmol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00±0.50,层析柱填料为toyopearl deae-650m阴离子交换凝胶。
4、进一步的,洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠120mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。
5、进一步的,洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠130mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。
6、进一步的,洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠140mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。
7、进一步的,层析柱平衡时使用ph为7.00±0.50的平衡液。
8、进一步的,平衡液包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠80~120mmol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l。
9、进一步的,平衡液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠80mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,平衡液ph为7.00。
10、进一步的,s/d病毒灭活后制品调整电导率与平衡液一致后进行层析柱上样。
11、s/d病毒灭活后制品上样前调整电导率与平衡液一致可以减少上样前s/d病毒灭活后制品的电导率波动,增大人凝血因子ⅷ和杂蛋白吸附能力差异,使大多数杂蛋白无法被吸附,而人凝血因子ⅷ蛋白恰能被吸附,更有利于分离纯化。
12、进一步的,层析柱洗脱时使用ph为7.00±0.50的洗脱液,洗脱液包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠1~2mol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l。
13、进一步的,洗脱液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠1mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗脱液ph为7.00。
14、本发明的有益效果在于:
15、本发明提供的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,在常规层析技术基础上,将单步洗涤优化为两步梯度洗涤,两步梯度洗涤的氯化钠浓度分别选择在一个合适的范围内,洗涤a的氯化钠浓度低,与s/d病毒灭活后制品浓度相当,采用洗涤液a洗涤后,可有效洗涤掉一些结合不牢固的杂蛋白,而不影响人凝血因子ⅷ,采用洗涤液b洗涤后,由于氯化钠浓度的适当提高,可在人凝血因子ⅷ效价的损失较少的前提下进一步洗涤掉部分结合较为牢固的杂蛋白,既能够满足去除杂蛋白的需求,又能尽量避免人凝血因子ⅷ的损失,实现了效价回收率和比活性的同时提高,对人凝血因子ⅷ的商业化生产有非常积极的影响,且在多次平行试验中发现,本发明受凝胶批次差异的影响较小,工艺表现稳定。
技术特征:1. 一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,步骤包括层析柱平衡、层析柱上样、层析柱洗涤和层析柱洗脱,层析柱洗涤时先后采用洗涤液a、洗涤液b进行两步梯度洗涤,洗涤液a包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠120~140mmol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠140~180mmol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00±0.50,层析柱填料为toyopearl deae-650m阴离子交换凝胶。
2.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠120mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。
3.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠130mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。
4.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,洗涤液a包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠140mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液b包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗涤液a、洗涤液b的ph均为7.00。
5.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,层析柱平衡时使用ph为7.00±0.50的平衡液。
6.如权利要求5所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,平衡液包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠80~120mmol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l。
7.如权利要求6所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,平衡液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠80mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,平衡液ph为7.00。
8.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,s/d病毒灭活后制品调整电导率与平衡液一致后进行层析柱上样。
9.如权利要求1所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,层析柱洗脱时使用ph为7.00±0.50的洗脱液,洗脱液包括枸橼酸钠10~20mmol/l、氯化钠1~2mol/l、甘氨酸120~150mmol/l和氯化钙1~3mmol/l。
10.如权利要求9所述的一种生产人凝血因子ⅷ的层析纯化工艺,其特征在于,洗脱液包括枸橼酸钠10mmol/l、氯化钠1mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化钙1mmol/l,洗脱液ph为7.00。
技术总结本发明涉及血液制品技术领域,具体涉及一种生产人凝血因子Ⅷ的层析纯化工艺,步骤包括层析柱洗涤,层析柱洗涤时先后采用洗涤液A、洗涤液B进行两步梯度洗涤,洗涤液A包括枸橼酸钠10~20mmol/L、氯化钠120~140mmol/L、甘氨酸120~150mmol/L和氯化钙1~3mmol/L,洗涤液B包括枸橼酸钠10~20mmol/L、氯化钠140~180mmol/L、甘氨酸120~150mmol/L和氯化钙1~3mmol/L,洗涤液A、洗涤液B的pH均为7.00±0.50,层析柱填料为Toyopearl DEAE‑650M阴离子交换凝胶,得到的人凝血因子Ⅷ比活性高、效价回收率高。技术研发人员:孙丰斌,张兴魁,师秀梅,张国栋,王健,候绪刚,陈政,乔福锋,郑志华受保护的技术使用者:山东泰邦生物制品有限公司技术研发日:技术公布日:2024/9/29本文地址:https://www.jishuxx.com/zhuanli/20241009/309080.html
版权声明:本文内容由互联网用户自发贡献,该文观点仅代表作者本人。本站仅提供信息存储空间服务,不拥有所有权,不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容, 请发送邮件至 YYfuon@163.com 举报,一经查实,本站将立刻删除。