miR-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用

本发明涉及mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用。

背景技术：

1、骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种软骨细胞或基质受损、丢失的退行性骨关节病，促进关节软骨的修复再生是治疗oa的关键。传统的oa治疗方式包括物理治疗、药物治疗以及手术治疗，这些治疗方式都不能根治oa。新兴的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)疗法因其血管阻塞、免疫排斥和致瘤性等问题，限制了其在oa治疗中的应用。mscs疗法在软骨修复中的作用被证明是依靠旁分泌所产生的外泌体(exosomes，exos)发挥的。因此，外泌体的研究对mscs治疗oa具有重要意义。

2、鹿茸干细胞是鹿茸快速生长的关键细胞。鹿茸干细胞被证实具有mscs特征，其通过增殖形成鹿茸的间充质层，并且分化成软骨细胞后又组成鹿茸的软骨层，鹿茸干细胞不断自我更新补充软骨细胞，维持鹿茸的快速生长而不引起癌变。鹿茸干细胞克服了以往mscs肿瘤趋向性、传代次数有限、细胞表型不一等问题，在软骨修复过程中有着重要研究意义。

技术实现思路

1、本发明提供了mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用。

2、本发明mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，按以下步骤进行：一、mir-140慢病毒载体感染鹿茸干细胞：向培养瓶中加入完全培养基，然后按照2×105cell/ml的密度加入鹿茸干细胞，37℃，5％co2恒温培养箱中孵育，待培养至细胞融合度为30-40％后进行转染；弃培养基，然后加入dmem洗涤细胞，在moi值为30的条件下加入转染液2.5ml，培养24h，再加入2.5ml转染液，继续培养24h，更换成完全培养基继续培养24h，然后q-pcr检测转染成功后即完成转染；

3、二、鹿茸干细胞外泌体的分离：将转染成功的鹿茸干细胞在完全培养基中培养至细胞融合度为60％-70％时，弃掉培养基，更换无外泌体血清培养基继续培养至细胞融合度为90％，然后收集上清进行第一次离心，离心后收取上清液进行第二次离心，再收集上清液进行第三次离心，收集上清液进行过滤，再进行第四次离心，收取沉淀，即为mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体。

4、本发明的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体在制备治疗关节炎药物中的应用。

5、所述mir-140的核苷酸序列为：5’-uaccacaggguagaaccacgga-3’，moi为感染复数(multiplicity ofinfection)。

6、本发明采用mirna抑制物(anti-mir-140)或类似物(mir-140)对mir-140的表达进行下调或上调，以nc-mir-140作为对照，将携带有mir-140、anti-mir-140、nc-mir-140的慢病毒分别转染鹿茸干细胞后进行筛选，得到稳定低表达或高表达mir-140的鹿茸干细胞系，超速梯度离心纯化收集鹿茸干细胞外泌体，使用不同修饰的鹿茸干细胞外泌体治疗oa软骨细胞，结果显示mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体促进了oa软骨细胞的增殖、迁移，抑制了凋亡和炎症作用，anti-mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体抑制了oa软骨细胞的增殖、迁移，促进了凋亡和炎症作用；进一步利用oa大鼠模型评价mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体对软骨损伤修复的水平，结果显示mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体促进软骨组织的损伤修复，anti-mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体抑制软骨组织的损伤修复。

7、本发明相对于现有技术的优点：

8、体外：与未经修饰的鹿茸干细胞外泌体相比，转染mir-140的鹿茸干细胞外泌体处理oa软骨细胞后可促进细胞的增殖、迁移，抑制凋亡和炎症作用；同时，在转录和翻译水平上，软骨形成标志基因colⅱ的表达量显著增加，软骨肥大化标志基因coli和colⅹ的表达量显著降低。上述结果说明转染mir-140的鹿茸干细胞外泌体促进oa软骨细胞的成软骨分化能力显著提升。

9、体内：与未经修饰的鹿茸干细胞外泌体相比，转染mir-140的鹿茸干细胞外泌体治疗oa大鼠后，mankin和oarsi评分最低；软骨形成标志基因colⅱ的表达量显著增加，软骨肥大化标志基因colⅹ和coli的表达量显著降低；炎症因子nlrp3的表达量显著降低。上述结果说明转染mir-140的鹿茸干细胞外泌体显著促进软骨组织的损伤修复及炎症的抑制。

技术特征：

1.mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行：

2.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于步骤一中加入转染液后的培养均在37℃，5％co2恒温培养箱中进行培养。

3.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于完全培养基的配方为：90％dmem+10％血清+1％双抗。

4.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于无外泌体血清培养基的配方为：90％dmem+10％无外泌体血清+1％双抗。

5.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于第一次离心是在4℃条件下，300×g离心15min。

6.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于第二次离心是在4℃条件下，2000×g离心30min。

7.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于第三次离心是在4℃条件下，10000×g离心30min。

8.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于第三次离心后的上清液采用0.22μm的无菌滤膜过滤。

9.根据权利要求1所述的mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法，其特征在于第四次离心是在4℃条件下，120000×g离心2h。

10.如权利要求1所述mir-140修饰的鹿茸干细胞外泌体在制备治疗关节炎药物中的应用。

技术总结miR‑140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用，本发明涉及miR‑140修饰的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用。本发明采用miR‑140对miR‑140的表达进行上调，将携带有miR‑140的慢病毒转染鹿茸干细胞后，得到稳定高表达miR‑140的鹿茸干细胞系，超速梯度离心纯化收集鹿茸干细胞外泌体，使用鹿茸干细胞外泌体治疗OA软骨细胞，结果显示miR‑140修饰的鹿茸干细胞外泌体促进了OA软骨细胞的增殖、迁移，抑制了凋亡和炎症作用；进一步利用OA大鼠模型评价miR‑140修饰的鹿茸干细胞外泌体对软骨损伤修复的水平，结果显示可以促进软骨组织的损伤修复。本发明应用于生物医药技术领域。技术研发人员：贾博寅,王雪,颜辛芮,张俣,刘威,刘畅,杜锐,李鑫,韩欣桐,王玉俗受保护的技术使用者：吉林农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29