一种犬瘟热病毒重组抗原及其在制备犬瘟疫苗中的应用的制作方法

本发明涉及一种犬瘟热病毒重组抗原及其在制备犬瘟疫苗中的应用，属于生物医药。

背景技术：

1、犬瘟俗称“狗瘟”，是由犬瘟热病毒(canine distempervirus，cdv)引起犬的一种高度接触性、致死性传染病。这种病死亡率很高，一般成犬可达50％以上，小犬感染后死亡率甚至可达80％以上。犬瘟热多发于冬春和秋冬寒冷季节，有一定的周期性，常3年1次大流行，目前呈世界性分布。

2、目前使用的犬瘟疫苗大致分为灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗通常免疫效价低维持时间短，不易产生局部抗体，抗原量比较大，成本较高。而弱毒疫苗有很大的潜在安全问题。重组疫苗是基于基因工程技术，选择目标病原体的特定抗原蛋白基因，将其插入到表达载体中，并将表达载体导入到宿主细胞中，表达目标抗原蛋白，通过对抗原蛋白的纯化和加工等步骤获得高纯度的重组疫苗。由于其安全性高、生产工艺成熟、可定制等优势在预防传染病中发挥重要作用，但抗原基因的设计限制了该技术的广泛应用。另外，重组疫苗也可以以dna或mrna疫苗形式实现，即将带有特定抗原蛋白基因的表达载体(dna或mrna)直接引入动物体内，通过在动物体内表达产生的蛋白，刺激免疫系统产生相应的抗体。因为dna或mrna疫苗不需要纯化抗原蛋白，疫苗的运输和保存条件也相对简单，大大降低了疫苗的成本，并加快了疫苗开发的速度。

3、病原学中犬瘟热病毒(cdv)属于副粘病毒科，麻疹病毒属。除了犬科动物(包括狗、狐狸、狼等)，犬瘟病毒还能够感染大熊猫、象科、大猫(如狮虎豹)、鼬科(雪貂、水獭等)、灵长类(如恒河猴、日本猴)等20多科的动物。cdv为单一负链rna病毒，长度约16000个核苷酸，主要编码六个结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(n)、融合蛋白(f)、血凝蛋白(h)、基质膜蛋白(m)、大蛋白(l)和磷蛋白(p)。其中的f和h是包膜蛋白，在病毒结合到细胞表面受体并侵入细胞的过程中起着决定性的作用。目前多采用cdv h蛋白作为重组抗原目标，但cdv h蛋白容易漂移，变异速度快，因此现在也有一些报道开始以cdv f蛋白作为重组抗原的新目标。但是，野生型的f蛋白表达量低，且众所周知，cdv表面的融合前f蛋白构象具有更丰富的中和抗体表位，因此在疫苗的开发过程中更希望获得相对稳定的融合前构象的抗原蛋白，而野生型的f蛋白一部分是融合前的构象，一部分是融合后的构象，这显然不利于抗原的应用。因此提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种表达量高、稳定性好、免疫原性强的重组抗原，该重组抗原能够有效诱导机体产生抗体，由该方法制备疫苗产品时操作简单，稳定、高效且质量可控。

2、本发明的第一个目的是提供一种蛋白，所述蛋白相对于seq id no.1所示的氨基酸序列具有以下突变：

3、将第78位亮氨酸突变为半胱氨酸，并将第94位缬氨酸突变为半胱氨酸(ds)；或

4、将第171位丝氨酸突变为脯氨酸(s306p)；或

5、将第78位亮氨酸突变为半胱氨酸，将第94位缬氨酸突变为半胱氨酸，并将第171位丝氨酸突变为脯氨酸(ds s306p)。

6、本发明的第二个目的是提供一种重组蛋白(本发明应用场景下为重组抗原)，所述重组蛋白含有上述蛋白、以及辅助原件。

7、进一步地，所述辅助原件包括但不限于辅助表达的信号肽、rbs等，也可以为辅助多聚体形成的多聚体形成序列。

8、进一步地，信号肽序列如seq id no.2所示；多聚体形成序列如seq id no.3所示。

9、本发明的第三个目的是提供编码上述蛋白或重组蛋白的核酸。

10、本发明的第四个目的是提供携带上述核酸的表达载体。

11、进一步地，所述表达载体可为质粒、核酸载体(如mrna)等等。

12、本发明的第五个目的是提供含有上述蛋白或重组蛋白的重组细胞。

13、进一步地，宿主细胞为细菌、真菌或疫苗生产细胞，如cho细胞、293t细胞、293f细胞等。

14、本发明的第六个目的在于提供上述蛋白、重组蛋白、核酸、重组质粒或重组细胞在制备预防或治疗犬瘟的产品中的应用。

15、本发明的第七个目的在于提供一种抗犬瘟热病毒抗体，以上述蛋白或重组蛋白为免疫原制备得到。

16、上述蛋白或重组蛋白可用于制备或筛选抗犬瘟热病毒抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体等。

17、本发明的第八个目的是提供一种预防或治疗犬瘟的产品(如疫苗)，产品中含有上述蛋白、重组蛋白、核酸、重组质粒或重组细胞。最优选地，疫苗中包括上述蛋白或重组蛋白，当然，还可以包括药学上可接受的辅料，如佐剂。

18、最优选地，疫苗为重组融合前三聚体蛋白疫苗，以c端融合三聚体底座序列(促进重组抗原单体三聚体化)的ds s306p为重组抗原。

19、本发明的第九个目的是提供一种生产cdv f蛋白的方法，将编码所述蛋白或重组蛋白的基因序列导入宿主细胞中，于适当条件下培养使其表达cdv f蛋白。当然，除了表达必需的原件如启动子、终止子等，为了提高表达量，本领域技术人员可以在表达框中添加促进表达的原件。

20、本发明的有益效果：

21、本发明通过cdv f蛋白序列比对，筛选出潜在突变位点，并对cdv f蛋白做了氨基酸取代。实验证明，特定位点的两种稳定取代(二硫键、空腔填充)不但极大提升了cdv f蛋白的表达水平(相对于野生型最高提升了30倍)，而且表达的f蛋白被锁定在其融合前的构象，从而为利用cdv f蛋白作为重组疫苗和筛选治疗性单抗提供了坚实的基础。

技术特征：

1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白相对于seq id no.1所示的氨基酸序列具有以下突变：

2.一种重组蛋白，其特征在于，含有权利要求1所述蛋白。

3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，还含有辅助原件，所述辅助原件包括多聚体形成序列。

4.编码权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述重组蛋白的核酸。

5.携带权利要求4所述核酸的表达载体。

6.含有权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述重组蛋白的重组细胞。

7.一种抗犬瘟热病毒抗体，其特征在于，以权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述重组蛋白为免疫原制备得到。

8.一种预防或治疗犬瘟的产品，其特征在于，权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述重组蛋白、权利要求4所述核酸、权利要求5所述表达载体、权利要求6所述重组细胞或权利要求7所述抗体。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为疫苗；所述疫苗为重组三聚体蛋白疫苗。

10.一种生产cdv f蛋白的方法，其特征在于，将编码权利要求1所述蛋白或权利要求2所述重组蛋白的基因序列导入宿主细胞中，于适当条件下培养使其表达cdv f蛋白。

技术总结本发明公开了一种犬瘟热病毒重组抗原及其在制备犬瘟疫苗中的应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了一系列CDV F蛋白突变体，其作为重组抗原时，于生产细胞中进行重组表达，解决了现有野生型CDV F蛋白表达量低的问题，同时，本发明的CDV F蛋白突变体的构象相对于野生型更稳定，F蛋白被锁定在其融合前的构象，基于融合前构象比融合后构象能引发更强的中和免疫反应，本发明的CDV F蛋白突变体可以作为一种更好的疫苗抗原，在犬瘟热病毒及其抗体等相关研究中具有巨大潜力。技术研发人员：张爽受保护的技术使用者：苏州医康贝生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10