一种紫薇花开放关键基因的克隆及应用

本发明涉及园林植物基因工程领域，特别是涉及一种紫薇花开放关键基因的克隆与应用。

背景技术：

1、紫薇(lagerstroemia indica l.)是千屈菜科紫薇属的落叶小乔木或灌木植物，据《本草纲目》记载，紫薇皮、木、花有活血通经、止痛、消肿、解毒等作用，紫薇花色鲜艳美丽，花期长，寿命长，可作盆景，园林布景是观花乔木，具有观赏价值，因紫薇有“官样花”之名，民间便有诊语：“门前种株紫薇花，家中富贵又荣华。”以紫薇花象征了富贵繁华之意。

2、紫薇存在单花开花时间短暂，国庆期间花期已过的缺陷。对紫薇花开放的分子机理展开探究，并筛选核心调控基因，有望从源头上改善紫薇单花期的不足。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种紫薇花开放关键基因的克隆与应用。

2、本发明还提供了一种紫薇花开放的扩展蛋白家族基因的筛选方法。

3、一种紫薇花开放关键基因liexla1和liexla2，其核苷酸序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。

4、本发明所述的紫薇花开放关键基因liexla1和liexla2的表达蛋白，其氨基酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。

5、用于克隆本发明所述的紫薇花开放关键基因liexla1和liexla2的特异性引物对，liexla1特异性引物对的核苷酸序列如seq id no:5和seq id no:6所示，liexla2特异性引物对的核苷酸序列如seq id no:7和seq id no:8所示。

6、含有本发明所述紫薇花开放关键基因liexla1或liexla2的表达载体。

7、本发明所述紫薇花开放关键基因liexla1或liexla2在植物生长发育中的应用。

8、本发明所述的应用，其中，所述紫薇花开放关键基因liexla1或liexla2能够促进植物的花开放过程。

9、本发明所述的应用，其中，所述紫薇花开放关键基因liexla1或liexla2能够增加植物茎粗、增加株高、促进植物根长和促进植物叶片的生长，所述紫薇花开放关键基因liexla1能够增加植物的莲座叶数量。

10、本发明所述的应用，其中，所述植物为拟南芥或紫薇。

11、一种紫薇花开放的扩展蛋白家族基因的筛选方法，包括如下步骤：基于pfam数据库的隐马尔可夫模型，搜索转录组中包含dpbb_1结构域pf03330和pollen_allerg_1结构域pf01357的基因，利用hmmer程序将可信度较高的候选基因筛选出来；同时，拟南芥扩展蛋白的蛋白序列从tair数据库下载，利用blast分析工具将下载的拟南芥蛋白序列同转录组蛋白序列进行比对，并设定了一个严格的阈值条件，即e-value<1×10-10，以确保筛选出的基因具有较高的可信度；最后，结合两种方法鉴定结果，取交集作为紫薇扩展蛋白的候选基因；然后通过ncbi的batch web cd-search tool和smart软件验证候选基因的保守结构域，将不含保守结构域的基因剔除后，获得最终紫薇exp基因。

12、本发明所述的紫薇花开放的扩展蛋白家族基因的筛选方法，其还包括如下步骤：

13、(1)使用在线工具expasy protparam计算紫薇exp家族蛋白质的氨基酸组成、等电点、分子量、疏水性等基本参数；利用在线网站plant-mploc对紫薇exp蛋白进行亚细胞定位预测；

14、(2)保守结构域和motif的分析：利用meme在线网站鉴定紫薇exp基因家族蛋白序列的保守基序，设置参数为：maximum number of motifs＝20；search model＝zero orone occurrence per sequence；其余均为默认参数值，获得并下载紫薇exp基因家族motif的mast文件；将下载的mast文件导入tbtools v1.098661软件，对motif进行可视化分析；利用ncbi的batch web cd-search tool下载得到紫薇exp基因家族的保守结构域dpbb1和pollen allerg1hitdata文件，并通过tbtools v1.098661软件对保守结构域进行可视化分析；

15、(3)多序列比对和系统进化分析：用jalview软件对紫薇exp基因家族的氨基酸序列进行比对，参数alignment选择muscle with defaults；对鉴定的紫薇扩展蛋白基因与拟南芥、烟草、水稻的扩展蛋白家族序列以及与桂花、月季、香石竹、唐菖蒲、蜡梅中与花开放相关的exp基因进行蛋白序列进行比对；上述植物中除拟南芥外，其他植物的蛋白序列均下载于在线网站planttfdb；基于上述exp蛋白序列，利用mega 11软件构建进化树，其中比对结果使用邻近法构建；接着，利用在线软件itol对构建的进化树进行编辑和美化；

16、(4)基因的表达模式分析：采集紫薇花开放四个时期s1，s2，s3和s4的样品，将样品在液氮中快速冷冻后，及时提研磨提取或置于-80℃冰箱保存；总rna的提取及反转录；采用primer 5.0软件设计引物，获得的基因及引物信息如表1所示。进行qrt-pcr扩增，对每个选择的基因进行3个重复，利用2-△△ct方法计算liexps基因的相对表达量。

17、表1紫薇扩展蛋白基因家族基因及引物

18、

19、本发明紫薇花开放关键基因的克隆与应用与现有技术不同之处在于：

20、本发明根据转录组测序结果克隆了liexla1和liexla2基因，并成功构建超表达载体；通过花序侵染法转入拟南芥，进行功能验证。本发明通过全长克隆对基因liexla1和liexla2进行克隆，并构建得到pore-liexla1-r4和pore-liexla2-r4重组植物表达载体，然后通过花序侵染法转基因到拟南芥。转liexla1和liexla2基因拟南芥株系均早于野生型拟南芥开花，且花瓣面积大于野生型拟南芥。根据表型结果分析表明紫薇liexla1和liexla2具有促进花开放作用。本发明为进一步探究基因liexla1和liexla2是否参与紫薇花开放进程奠定基础。

21、经过转录组数据的深入筛选，研究筛选出27个紫薇扩展蛋白基因序列。通过对这些序列进行系统进化分析，成功地将它们划分为四个不同的亚族。观察发现，同一亚族内的成员在基因结构以及保守基序上表现出显著的一致性。进一步分析显示，这些基因所编码的蛋白质长度介于249至323个氨基酸之间，分子量则介于26.54至35.65kd之间。此外，这些蛋白质的等电点也表现出一定的范围，为4.77至9.56。利用qrt-pcr分析扩展蛋白基因家族在紫薇花开放进程中的表达模式，根据研究，基因liexp22、liexpb1、liexpb2和liexlb1在花开放的前两个时期展现出较高的转录水平，这表明它们可能对于花开放初期液泡的扩展起到了重要的推动作用。而基因liexpa19，liexpa20，liexpa21，liexla1和liexla2在紫薇花开放过程中的后两个阶段表达量显著增强，推测这五个基因可能是紫薇花开放功能中的关键调控因子。这些基因的表达上调可能直接影响到紫薇花开放过程，从而使它们在花开的机制中占据重要地位。本发明揭示出motif模式在扩展蛋白亚家族中的保守性，这一发现突显了其在亚家族中的标志性地位，为理解扩展蛋白的功能和进化提供了重要线索。本发明基于紫薇花开放转录组数据对紫薇扩展蛋白家族进行鉴定，并通过生物信息学软件，分析紫薇扩展蛋白家族的特征和变化，为进一步研究紫薇花开放分子机制打下坚实基础。

22、下面结合附图对本发明的紫薇花开放关键基因的克隆与应用作进一步说明。