一种检测3-氨基酪氨酸或3-硝基酪氨酸的方法

本发明属于生物标志物分析检测领域，更具体地，涉及一种检测3-氨基酪氨酸或3-硝基酪氨酸的方法。

背景技术：

1、蛋白质酪氨酸硝化(protein tyrosine nitration,ptn)是机体氧化还原稳态失衡下发生的一种常见的蛋白质翻译后修饰，常指蛋白酪氨酸酚环上3号位的氢被硝基取代生成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-nt)。目前，检测体液、组织或细胞中3-nt水平的方法主要分为三大类。一是仪器分析方法，如利用hplc，gc/lc-ms，maldi-tof ms等来检测3-nt和含3-nt的蛋白，此类检测方法缺陷主要是样品前处理复杂；二是抗3-nt抗体方法，如western blot，elisa，免疫沉淀等，该方法存在检测步骤繁杂、费用高等缺陷；三是具有3-nt选择性的化学类检测方法，此类方法先将3-nt还原为3-氨基酪氨酸(3-aminotyrosine，3-at)，再将3-at转化为荧光物质进行检测。此类方法大多需经历复杂的有机分子探针合成过程，且检测步骤繁多、生物兼容性较差，标记蛋白样品时会造成部分蛋白样品的损失等缺陷。

2、最近的研究表明，体内3-nt也会被还原为3-氨基酪氨酸(3-aminotyrosine，3-at)。而这种新的蛋白质翻译后修饰的生物学意义尚缺乏探索，主要的原因在于缺乏有效且特异性地检测机体3-at水平的方法。虽然近期有报道基于水杨醛的荧光探针用于检测细胞中3-at水平的方法，但该方法一方面探针合成步骤繁杂，另一方面，检测时需先标记目标蛋白样品再进行凝胶荧光成像，这可能会因为实验条件和检测环境苛刻造成蛋白降解，降低检测的准确度。

3、现有检测方式的不足突出了研究蛋白质酪氨酸硝化或氨基化迫切需要新型可靠的分析方法。开发步骤简单、高选择性和灵敏性的检测方法对于研究蛋白质酪氨酸硝化或氨基化的生理学意义具有重大帮助。

技术实现思路

1、本发明将含3-氨基酪氨酸结构的待测样品与式ⅰ醛基化合物及金属离子“一锅法”反应，酪氨酸苯环上的氨基先与式ⅰ结构中的醛基反应，生成含亚胺结构(hc＝n)的配体，接着，铝离子与该亚胺结构上的氮原子、3-氨基酪氨酸结构上氨基邻位羟基上的氧原子，以及式ⅰ上醛基邻位羟基上的氧原子配位，形成在430-480nm波长范围激发下具有亮黄色荧光的荧光络合物，然后用生成的荧光络合物来指示待测物质的存在，达到检测3-氨基酪氨酸的目的。本发明只需将3-硝基酪氨酸还原为3-氨基酪氨酸，然后再按照以上方法进行检测，就达到检测3-硝基酪氨酸的目的。本发明解决了现有技术中存在的样品前处理复杂、检测步骤繁杂、及由此产生的检测准确度低和费用高等技术问题。

2、根据本发明第一方面，提供了一种检测3-氨基酪氨酸的方法，将待测样品加入到式ⅰ所示结构的化合物和铝离子的混合溶液中，所述待测样品中3-氨基酪氨酸结构与式ⅰ上的醛基充分反应，生成含亚胺结构的配体，然后，所述混合溶液中的铝离子与所述亚胺结构上的氮原子、所述3-氨基酪氨酸结构上氨基邻位羟基上的氧原子，以及所述式ⅰ上醛基邻位羟基上的氧原子配位，形成在430-480nm波长范围激发下具有亮黄色荧光的荧光络合物；通过检测该荧光络合物的荧光强度，计算得到待测样品中3-氨基酪氨酸的浓度；所示式ⅰ为：

3、

4、其中r为-h、-ch3、-och3或苯环。

5、优选地，所述待测样品为3-氨基酪氨酸、酪氨酸氨基化多肽和酪氨酸氨基化蛋白中的至少一种。

6、优选地，式ⅰ所示结构的化合物的浓度为50-500μm，铝离子的浓度为50-500μm；反应在ph 5-6的缓冲溶液中进行，室温条件下孵育24小时以内。

7、优选地，当待测样品为氨基酸或多肽时，检测过程在水相中进行；设置激发波长430-450nm，最大发射波长520-540nm测定荧光强度；

8、当待测物为蛋白时，检测过程在水相中进行或者在凝胶上进行；在水相中测定时，设置激发波长430-450nm，最大发射波长520-540nm测定荧光强度；在凝胶上测定时，设置激发波长440-480nm，最大发射波长520-550nm测定荧光强度。

9、根据本发明第二方面，提供了一种检测3-硝基酪氨酸的方法，将待测样品还原后加入到式ⅰ所示结构的化合物和铝离子的混合溶液中，形成在430-480nm波长范围激发下具有亮黄色荧光的络合物；通过检测该络合物的荧光强度，计算得到待测样品中3-硝基酪氨酸的浓度。

10、优选地，待检测样品与还原剂na2s2o4的摩尔比为1：(1-500)。

11、优选地，所述待测样品为3-硝基酪氨酸、酪氨酸硝化多肽和酪氨酸硝化蛋白中的至少一种。

12、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

13、(1)本发明的检测策略中所涉试剂廉价易得，检测条件温和，特异性强，反应在水相、生理ph范围内即可进行，具备较好的生物兼容性。

14、(2)还原剂的存在不干扰后续反应的进行，检测过程中无需分离、纯化等手段，使得整个反应过程可“一锅式”进行。

15、(3)在检测蛋白样品时，可先对蛋白样品进行电泳分离，再直接用式ⅰ所示化合物及铝离子混合溶液对蛋白凝胶进行孵育，之后对凝胶进行荧光成像达到检测目的。与目前报道的荧光成像方法(先标记目标蛋白再电泳分离)相比，本发明提供的这种先电泳分离待测蛋白样品再进行目标标记的检测方式可最大程度保证待测蛋白样品的完整性，提升检测的准确度。

16、(4)与同类检测方案相比，在具备同样检测能力(pmol级)的前提下，本发明的检测条件更温和，流程更简单，且无需合成复杂的分子探针。与现行免疫学分析检测方法，即使用抗3-硝基酪氨酸抗体法相比，在检测能力相当的前提下，我们的检测成本大幅降低，且流程更加简化。

技术特征：

1.一种检测3-氨基酪氨酸的方法，其特征在于，将待测样品加入到式ⅰ所示结构的化合物和铝离子的混合溶液中，所述待测样品中3-氨基酪氨酸结构与式ⅰ上的醛基充分反应，生成含亚胺结构的配体，然后，所述混合溶液中的铝离子与所述亚胺结构上的氮原子、所述3-氨基酪氨酸结构上氨基邻位羟基上的氧原子，以及所述式ⅰ上醛基邻位羟基上的氧原子配位，形成在430-480nm波长范围激发下具有亮黄色荧光的荧光络合物；通过检测该荧光络合物的荧光强度，计算得到待测样品中3-氨基酪氨酸的浓度；所示式ⅰ为：

2.一种检测3-硝基酪氨酸的方法，其特征在于，将待测样品还原为3-氨基酪氨酸，然后再按照权利要求1所述的方法进行检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，待检测样品与还原剂na2s2o4的摩尔比为1：(1-500)。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，式ⅰ所示结构的化合物的浓度为50-500μm，铝离子的浓度为50-500μm；反应在ph 5-6的缓冲溶液中进行，室温条件下孵育24小时以内。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为3-氨基酪氨酸、酪氨酸氨基化多肽和酪氨酸氨基化蛋白中的至少一种。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测样品为3-硝基酪氨酸、酪氨酸硝化多肽和酪氨酸硝化蛋白中的至少一种。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当待测样品为氨基酸或多肽时，检测过程在水相中进行；设置激发波长430-450nm，最大发射波长520-540nm测定荧光强度；

技术总结本发明涉及一种检测3‑氨基酪氨酸或3‑硝基酪氨酸的方法，属于生物标志物分析检测领域。将含有3‑氨基酪氨酸结构的待测样品加入到式Ⅰ所示结构的化合物和铝离子的混合溶液中，形成在430‑480nm波长范围激发下具有亮黄色荧光的络合物；通过检测该荧光络合物的荧光强度以得到待测物的浓度。检测3‑硝基酪氨酸时，可先将3‑硝基酪氨酸还原为3‑氨基酪氨酸。本发明提供的检测方法检测限量低(10pmol)，特异性强，检测条件温和，步骤简单，可直接实现体液、组织匀浆液中的荧光定量检测。与现行的抗体类检测方法相比，在最低检测限相当的前提下，本发明的检测成本更低，流程更简单。技术研发人员：李海玲,杨劲文,高中洪受保护的技术使用者：华中科技大学技术研发日：技术公布日：2024/10/17