一种显示蒲公英乳管及天然橡胶的石蜡切片方法

本发明公开了一种显示蒲公英乳管及天然橡胶的石蜡切片方法，属于石蜡切片。

背景技术：

1、蒲公英是菊科蒲公英属多年生草本植物，适应性强，在中国分布范围极广，共计有70多种。蒲公英中含有多种次生代谢物质，其中黄酮类和多糖是主要的活性成分。蒲公英日益受重视的另一种次生代谢物是天然橡胶。天然橡胶作为一种重要的工业原材料和战略物质，主要来自巴西橡胶树。巴西橡胶树是一种原产南美亚马孙河流域热带雨林的乔木，对生长环境有极大的要求，在中国主要种植在海南，广东和云南。由于国内的橡胶树种植面积受限，天然橡胶年产量约80万吨，而中国是当前世界上第一橡胶消费国，2020年消耗约640万吨，自给率不足15％，远低于30％的安全警戒线。因此，开发具有更广泛环境适应性的新型产胶作物，保障战略物资自给安全，减少对单一作物的依赖，是当前天然橡胶产业的发展方向之一。

2、蒲公英属植物通常含有乳管，其内合成天然橡胶。目前，已知橡胶草(蒲公英属的一种)内含有较高的天然橡胶含量，且适应寒冷气候，种植范围广泛。蒲公英中其它种质乳管数量如何，是否具有开发的价值目前并不清楚，如何从蒲公英不同种质中筛选乳管数量多，尤其是合成天然橡胶丰富的种质，对于寻找产胶替代植物资源尤为重要。产胶植物的乳管中合成天然橡胶的细胞器是橡胶粒子，该细胞器具有丰富的磷脂膜结构，合成的天然橡胶贮存在橡胶粒子内部。目前，从光学水平上鉴定橡胶草乳管，主要包括油红染色法，即利用油红染色脂类的特征，通过染色橡胶粒子等细胞器的磷脂膜结构来判断是否是乳管组织，这一方法染色特定细胞的专一性不强。另一种是根据巴西橡胶树的乳管显示方法而来，即利用碘-溴染液对乳管内的天然橡胶进行变性和染色，特异标记乳管，这一方法可以制备为永久保存的石蜡切片，但目前并没有一套适合蒲公英等草本幼嫩植物组织的方法，yuan等的结果中橡胶草组织破碎非常严重，导致组织观察效果很差。张馨文和刘丽萍对蒲公英进行观察，但很明显，该文中显示的乳管是导管，番红并不能特异染色乳管。冰冻切片技术虽然也能对橡胶草的乳管进行分析，但不能永久保存，特异性也不强，并且需要昂贵的冰冻切片机。

3、由此可见，建立一套特异定位草本蒲公英乳管组织和其内天然橡胶的石蜡切片技术对于蒲公英乳管生物学研究以及产胶种质的鉴定和资源挖掘都具有重要的意义。

技术实现思路

1、基于上述分析，本发明利用天然橡胶被碘-溴特异染色的特点，结合蒲公英多糖、多酚等草本的特点，研发了一套组织保存完整、特异标记乳管及其内含天然橡胶的石蜡切片方法。本发明是通过如下技术手段来实现的：

2、本发明公开了一种显示蒲公英乳管及天然橡胶的石蜡切片方法，包括如下步骤：

3、(1)采集蒲公英全草，清洗干净根部，除去粘附的土壤等杂物；

4、(2)将单面刀片烧热，趁热切取根部组织，减少胶乳的流失；

5、(3)根据试验需要，分割成大小合适的小块组织；

6、(4)材料于4％戊二醛磷酸溶液(ph7.2)中，抽气后4℃固定24h；

7、(5)0.1m磷酸缓冲溶液(ph7.2)中清洗3次，每次10min；

8、(6)乙醇梯度脱水，30％、50％、70％、80％、90％乙醇，每步30min，然后无水乙醇脱水3次，每次60min；

9、(7)冰乙酸过渡，分别为乙醇：乙酸体积比为2：1、1：1、1：2，每步30min；然后纯乙酸2次，每次30min；

10、(8)碘-溴染液，60℃加热染色30h；

11、(9)冰乙酸清洗3次，每次1h；

12、(10)脱冰，乙酸：乙醇体积比为1：1，过渡30min；然后乙醇2次，每次1h；

13、(11)正丁醇透明，乙醇：正丁醇体积比为1：1，30min；然后正丁醇3次，每次1.5h；

14、(12)渗蜡过渡，即正丁醇：石蜡体积比为1：1，60℃加热12h；

15、(13)石蜡渗透，三次，60℃加热，每步2-3h；

16、(14)包埋；

17、(15)常规切片，厚度10-15μm，展片后45℃烘片24h；

18、(16)脱蜡，二甲苯脱蜡2次，每次10min；

19、(17)染色，即1％固绿(溶于95％乙醇)染色5-10min，然后95％乙醇脱去浮色；

20、(18)乙醇脱水2次，每次10min；

21、(20)二甲苯透明3次，每次30min，中性树胶封片。

22、进一步地，步骤(4)中的4％戊二醛磷酸溶液(ph7.2)的配制：取16ml的市售戊二醛原液(25％浓度)，加入0.2m的磷酸缓冲液(ph7.2)50ml，最后加入34ml超纯水定容到100ml。

23、进一步地，步骤(8)中的碘-溴染液为5g碘粉末，加入到100ml冰醋酸中，充分溶解后，加入0.4ml的溴液，充分混匀，密封避光保存备用。

24、进一步地，步骤(17)中的固绿染液为1g固绿干粉充分溶解在95％纯度的乙醇中，定容到100ml。

25、本发明的有益效果在于：

26、本发明利用4％戊二醛固定能更好的保存组织，避免后续处理有机溶剂对组织成分的抽提；相对橡胶树等木本植物的组织，缩短每步的处理时间，尤其是降低碘-溴染色的时间，但同时保证每步处理的效果；降低渗蜡温度，减小高温对组织的损伤；最终获取结构完整的石蜡切片，尤其是形成层等幼嫩的结构保持完好，乳管中的天然橡胶染色鲜明，不同的种质之间有明显的差异，这不仅为分析蒲公英属植物中乳管的分布和天然橡胶的含量提供了形态学上的研究方法，也为优良产胶替代植物的筛选提供了技术支持。

技术特征：

1.一种显示蒲公英乳管及天然橡胶的石蜡切片方法，包括：

2.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

3.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

4.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

5.根据权利要求4所述的石蜡切片方法，其中：

6.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

7.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

8.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

9.根据权利要求1所述的石蜡切片方法，其中：

10.根据权利要求9所述的石蜡切片方法，其中：

技术总结本发明公开了一种显示蒲公英乳管及天然橡胶的石蜡切片方法，以角苞、大头和反苞蒲公英为研究材料，利用4％戊二醛固定能更好的保存组织，避免后续处理有机溶剂对组织成分的抽提；相对橡胶树等木本植物的组织，缩短每步的处理时间，尤其是降低碘‑溴染色的时间，但同时保证每步处理的效果；降低渗蜡温度，减小高温对组织的损伤；最终获取结构完整的石蜡切片，尤其是形成层等幼嫩的结构保持完好，乳管中的天然橡胶染色鲜明，不同的种质之间有明显的差异，这不仅为分析蒲公英属植物中乳管的分布和天然橡胶的含量提供了形态学上的研究方法，也为优良产胶替代植物的筛选提供了技术支持。技术研发人员：史敏晶,蒋毅,张世鑫,田维敏受保护的技术使用者：中国热带农业科学院橡胶研究所技术研发日：技术公布日：2024/10/17