一种外周血γδT细胞的冻存方法和冻存液与流程

本发明涉及生物制药，特别是涉及一种外周血γδt细胞的冻存方法和冻存液。

背景技术：

1、大多数细胞样品在收集后的几个月内输注；然而，需要多次输注，就需要长期储存。在所有的病例中，所有的细胞样品都是在第一次移植前收集的，而随着疾病晚期和血液毒性增加累积，在治疗过程中采集外周血具有挑战性。

2、外周血γδt细胞低温保存在氮气液相或气相中，直到解冻和再灌注。传统的低温保存方法包括控制速率的冷冻和二甲亚砜(dmso)作为低温保护剂。几十年来，dmso是一种被验证的长期骨髓或外周血干细胞储存的添加剂，保护细胞免受冰晶的形成和由此导致的细胞损伤。在这些条件下，细胞样品可以长期储存，从数月到数年不等。

3、生存能力表征依赖于间接的测量，因此，对于其捕获长期存储后的γδt细胞的功能完整性和效力的能力仍然存在问题。死亡的细胞被识别出来并被排除在外使用活性染料进行cd3+分析。然而，膜完整性活力测量与解冻后细胞条件和功能相关性较差。染料排除法只检测细胞死亡的最新阶段，而冷冻和解冻可能导致仍在存活的细胞出现更微妙的功能损伤。换句话说，在解冻γδt的标准质量控制标准中使用的可行的cd3+计数并不能保证γδt的功能和效力得到保留。事实上，尽管解冻后活的cd3+计数很高，但移植失败的病例表明了超低温保存后γδt细胞功能检查的错误保证问题。γδt细胞计数可以与cfu实验相结合，进一步评估整个γδt及其单个细胞亚群的功能能力。低温保存和解冻可能导致有核细胞总数、细胞活力和形成单位(cfu)的显著损失。

4、目前对于提高γδt的长期稳定性和解冻后效力的研究较少。专门研究外周血细胞样品的研究比较有限，大多数只考虑相对较短的储存时间。只有几项研究涉及了超过6年的存储周期。许多研究的另一个局限性是在分析中缺乏功能细胞分析验证。

5、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于克服上述背景技术的缺陷，提供一种外周血γδt细胞的冻存方法和冻存液，使γδt细胞长期冷冻后仍可很好地保持质量和效力。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种外周血γδt细胞的冻存方法，包括：

4、将外周血γδt细胞放入冻存液中进行超深低温冷冻保藏，所述冻存液含有有效量的ossirene和冷冻保护剂。

5、进一步地，所述冻存液含有0.1mm-5mm的ossirene。

6、进一步地，所述冻存液含有0.5mm的ossirene。

7、进一步地，所述冷冻保护剂为dmso，体积比浓度为70％至95％。

8、进一步地，dmso的体积比浓度为90％。

9、进一步地，可安全保存的期限为6年以上。

10、一种外周血γδt细胞的冻存液，含有有效量的ossirene和冷冻保护剂。

11、进一步地，所述冻存液含有0.1mm-5mm的ossirene。

12、进一步地，所述冻存液含有0.5mm的ossirene。

13、进一步地，所述冷冻保护剂为dmso，体积比浓度为70％至95％。

14、本发明具有如下有益效果：

15、本发明提供了一种创新的外周血γδt细胞冻存方法，该方法通过使用含有有效量的ossirene和冷冻保护剂的冻存液，实现了对γδt细胞的长期低温安全保存。与传统的低温保存方法相比，本发明的冻存液不仅能够保护细胞免受冰晶形成导致的损伤，而且还能在细胞复苏后显著提高其活力。实验结果表明，使用本发明的冻存液，即使在长期(6年)低温保存条件下，γδt细胞的质量和效力也未受到明显负面影响，细胞的存活率、代谢活性和细胞内ph均保持在良好状态，凋亡细胞比例与新鲜细胞相比无显著差异。本发明不仅提高了γδt细胞冻存的长期稳定性，还为自体γδt细胞的临床应用提供了一种安全、可靠的冻存解决方案。

16、本发明实施例中的其他有益效果将在下文中进一步述及。

技术特征：

1.一种外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存液含有0.1mm-5mm的ossirene。

3.根据权利要求2所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存液含有0.5mm的ossirene。

4.根据权利要求1至3任一项所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为dmso，体积比浓度为70％至95％。

5.根据权利要求4所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，dmso的体积比浓度为90％。

6.根据权利要求1至3任一项所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，可安全保存的期限为6年以上。

7.一种外周血γδt细胞的冻存液，其特征在于，含有有效量的ossirene和冷冻保护剂。

8.根据权利要求7所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存液含有0.1mm-5mm的ossirene。

9.根据权利要求8所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存液含有0.5mm的ossirene。

10.根据权利要求6至9任一项所述的外周血γδt细胞的冻存方法，其特征在于，所述冷冻保护剂为dmso，体积比浓度为70％至95％。

技术总结一种外周血γδT细胞冻存方法和冻存液，该方法通过使用含有有效量的Ossirene和冷冻保护剂的冻存液，实现了对γδT细胞的长期低温安全保存。与传统的低温保存方法相比，本发明的冻存液不仅能够保护细胞免受冰晶形成导致的损伤，而且还能在细胞复苏后显著提高其活力。实验结果表明，使用本发明的冻存液，即使在6年的长期低温保存条件下，γδT细胞的质量和效力也未受到明显负面影响，细胞的存活率、代谢活性和细胞内pH均保持在良好状态，凋亡细胞比例与新鲜细胞相比无显著差异。本发明不仅提高了γδT细胞冻存的长期稳定性，还为自体γδT细胞的临床应用提供了一种安全、可靠的冻存解决方案。技术研发人员：刘佳受保护的技术使用者：深圳市中佳生物医疗科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4