一种CRISPR质粒与引物设计系统

本发明属于生物信息学，特别是涉及一种crispr质粒与引物设计系统。

背景技术：

1、crispr-cas9技术利用了细菌抵抗外源核酸入侵机制：成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)及其相关蛋白9(crispr associated proteins 9,cas9)开发出了的有极高实用价值基因编辑技术。其工作原理是crrna(crispr derived rna)与tracrrna(trans-activating rna)结合形成具有特异性引导作用的单向导rna(single guide rna,sgrna)，并由sgrna引导核酸酶cas9蛋白对靶基因进行定点精确切割，主要通过同源重组修复(homology directedrepair,hdr)或非同源末端连接修复(non-homologous end-joining,nhej)对靶基因进行编辑。该基因编辑技术显示出强大的优势，编辑更加准确且效率高，设计构建更加方便且极大降低实验难度和缩短实验周期，且可多个靶位点同时进行基因打靶，使其快速在不同研究领域得到了广泛的应用。多重crispr技术是在单一sgrna质粒系统的基础上，通过表达多个sgrna去切割多个靶点，从而提高crispr基因编辑的效率，尤其适用于切除大片段基因、一次编辑多个基因。构建多重crispr质粒的方法有多种，诸如利用标准sgrna表达框串联、csy4切割表达框、trna-ptg表达框、核酶自剪切等。其中串联sgrna表达框的方法的质粒功能元件取材方便，最为常用，但也存在需要多轮克隆、耗时长的缺点。本课题组在前期研究中提出一种新方法，利用iis型内切酶的切割特点，采用golden gate连接方法，仅需一轮克隆，即可完成至少四个表达框串联的多重crispr质粒的构建。该法的关键在于pcr引物的特殊设计：将酶切位点、sgrna序列作为引物5'端附加序列，除首、尾之外的中间sgrna被分离到不同片段的引物上，在切连反应过程中，分离的sgrna引物端又重新“无缝”连接形成完整的sgrna，即“引物重合”，由此建立含有多个sgrna的串联表达crispr质粒。正是因为“引物重合法”构建多重crispr质粒的引物设计原理特殊，目前尚无商业或开源的引物设计软件可供直接应用，为了增加“引物重合法”的实用性，亟需开发适用的引物设计软件。随着信息技术的迅猛发展，软件的开发也取得了极大的进步，面对对象的编程软件及其方便的图形操作界面，使得软件编程更加简便易用，众多的代码托管平台，也为软件开发和后期运行与维护提供了稳定的支持。本团队及课题组拟在前期多重crispr质粒构建的研究基础上，将现代基因编辑技术与信息技术有机融合，通过开发专门的适用软件，为“引物重合法”crispr质粒构建提供软件支持；进一步通过细胞水平的基因编辑，验证该方法的实用性，为多种生物的基因编辑提供一种通用、易用的高效技术手段。研发出适用于“引物重合法”构建多重crispr质粒的引物设计软件；验证本软件设计出的引物的正确性及其基因编辑效果；为高效crispr基因编辑提供新型实用的工具和方法。以“引物重合法”构建多重sgrna串联表达crispr质粒的原理为指导，编写专用程序和设计界面，研发专用引物设计软件。

2、根据公示的一种crispr技术质粒与引物设计系统(公开号：cn117316287a)，该发明公开了一种可以允许客户给定基因组、给定crispr技术母版载体、允许对多个靶点进行批量的引物和质粒图谱设计，输出的结果除grna核糖核酸及质量评估以外，还提供了可用于扩增grna核糖核酸、同源臂、载体骨架的引物、鉴定引物以及方便后续克隆构建时的测序数据比对以及追溯的质粒图谱。本发明通过“引物重合”策略克服了常规多重编辑带来的克隆次数多、克隆效率低的问题。设计完整引物的同时满足扩增获得完整的目标脱氧核糖核酸序列及3'端特异性更高的要求，但是，上述系统中，模块与单元之间缺少扩增插入模块，导致各个分析处理器内部出现新增数据时，无法记录并参与实验，导致实验结果不准确，有待改进。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种crispr质粒与引物设计系统，通过合成模块与提取基因模块互动通，致使提取基因模块提取目标基因序列的工具，为后续的crispr实验设计和操作提供必要的基因材料，解决了现有的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明为一种crispr质粒与引物设计系统，包括数据集成与登录模块，所述数据集成与登录模块的输出端设置有操作模块，所述操作单元的输出端设置有calculate模块，所述calculate模块的输出端设置有copy模块。

4、进一步地，所述操作单元包括限制性内切酶模块和u启动子模块，所述操作单元内部模块之间设置有独立存储器。这是系统的核心模块，负责限制性内切酶模块通常用于构建crispr质粒的骨架，以便将cas基因以及与目标基因相匹配的rna引物序列插入到目标细胞中。这个模块的主要作用是帮助将crispr相关基因和引物序列整合到质粒中，使其能够在目标细胞中进行基因编辑。

5、进一步地，所述calculate模块包括输入模块和生成模块，所述calculate模块内部模块之间设置有独立存储器。calculate模块在crispr质粒与引物设计系统中扮演着重要的角色，帮助用户快速、准确地设计和优化符合要求的crispr引物，从而实现对目标基因的精确编辑和调控。calculate模块通常用于计算和优化crispr引物的设计。这个模块的主要功能是根据输入的目标基因序列，自动计算出最佳的引物设计方案，以实现对目标基因的精确编辑和调控。

6、进一步地，所述copy模块包括显示模块和粘贴模块，所述copy模块内部模块之间设置有独立存储器。copy模块在crispr质粒与引物设计系统中是一个用于复制已设计序列的工具，可以帮助用户快速、方便地将已有的设计结果复制到新的文件或项目中，以支持后续的编辑、分析和应用。copy模块通常用于复制已经设计好的crispr质粒和引物序列。这个模块的主要功能是帮助用户将已经设计好的crispr质粒或引物序列复制到新的文件或项目中，以便进一步编辑、分析或应用。

7、进一步地，所述copy模块的输出端设置有合成模块，所述合成模块的输出端设置有扩增插入模块，所述扩增插入模块的输出端设置有切连反应模块。合成模块在crispr质粒与引物设计系统中是一个用于将设计好的crispr质粒或引物序列转化为实际的dna序列的工具，为后续实验操作和应用提供必要的材料基础。合成模块通常用于合成crispr质粒或引物序列。这个模块的主要功能是将设计好的crispr质粒或引物序列转化为实际的dna序列，以便后续的实验操作或应用。

8、进一步地，所述合成模块与提取基因模块互动通，所述提取基因模块的输出端与扩增插入模块相连。提取基因模块在crispr质粒与引物设计系统中是一个用于从基因组或其他来源中提取目标基因序列的工具，为后续的crispr实验设计和操作提供必要的基因材料。提取基因模块通常是用于从基因组或其他来源中提取目标基因序列的工具。这个模块的主要功能是帮助用户获取他们感兴趣的基因序列，以用于后续的crispr质粒构建或引物设计。

9、进一步地，所述扩增插入模块与提取载体模块互通，所述提取载体模块的输出端与切连反应模块相连。切连反应模块在crispr质粒与引物设计系统中扮演着重要角色，帮助用户模拟、优化和验证dna连接过程，为crispr基因编辑和重组dna操作提供支持和指导。切连反应模块是一个重要的模块，用于模拟和优化dna切断和连接的过程，特别是在构建crispr质粒或进行重组dna操作时。

10、进一步地，所述切连反应模块的输出端设置有转化模块，所述转化模块的输出端设置有筛选及鉴定模块。筛选及鉴定模块在crispr质粒与引物设计系统中是一个关键的工具，帮助用户选择最佳的crispr质粒或引物，并为后续的实验设计和操作提供支持和指导。筛选及鉴定模块是用于评估设计的crispr质粒或引物的性能和有效性的工具。这个模块的主要功能是帮助用户选择最佳的crispr质粒或引物，以确保在实验中获得最佳的基因编辑效果。

11、本发明具有以下有益效果：

12、1、本发明通过合成模块与提取基因模块互动通，致使提取基因模块提取目标基因序列的工具，为后续的crispr实验设计和操作提供必要的基因材料，这个模块的主要功能是帮助用户获取他们感兴趣的基因序列，以用于后续的crispr质粒构建或引物设计。

13、2、本发明通过提取载体模块的输出端与切连反应模块相连，致使切连反应模块帮助用户模拟、优化和验证dna连接，为crispr基因编辑和重组dna操作提供支持和指导，模拟和优化dna切断和连接的过程。

14、3、本发明通过切连反应模块的输出端设置的转化模块，致使转化模块将转化后的大肠杆菌输入至筛选及鉴定模块中，帮助用户选择最佳的crispr质粒或引物，并为后续的实验设计和操作提供支持和指导。

15、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。