一种快速网织红细胞染色试剂及其应用的制作方法

本发明属于细胞明场识别用的染色，涉及一种快速网织红细胞染色试剂及其应用。

背景技术：

1、网织红细胞是红细胞在成熟过程中的一个过渡阶段，是介于未成熟的红细胞(原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞)与成熟红细胞之间的一种形态。它们对于理解造血功能、评估贫血状况及血液疾病的治疗效果等方面具有重要意义。网织红细胞在血液中的数量比例(网织红细胞百分率)和绝对值(网织红细胞计数)反映了骨髓生成红细胞的能力和速度，是评估机体红细胞生成状态的重要指标。在贫血的诊断过程中，网织红细胞计数有助于判断贫血的类型。如再生障碍性贫血(aa)患者的网织红细胞计数通常显著降低，提示骨髓红系造血功能减低；而溶血性贫血患者则表现为网织红细胞计数明显增高，反映骨髓对红细胞破坏后的代偿性增生。正常人的网织红细胞占比约为0.5-1.5％。

2、网织红细胞胞浆内含有一种称为网状结构的嗜碱性物质，这是由核糖核酸(rna)、蛋白质和少量线粒体等成分组成的未完全退化的细胞器。这些网状物质在瑞氏染色或煌焦油蓝染色下呈现蓝色或紫色，通过显微镜油镜可以清晰观察到。如未经染色，网织红细胞无法与正常红细胞区分。

3、现有研究中，已有专门针对网织红细胞的染色方法，如“网织红细胞计数的参考方法”中说明了一种网织红细胞的染色方法，其中直接采用了磷酸盐用作缓冲盐提供一个等渗的离子浓度环境，采用新亚甲蓝染料进行染色，将血液样本和染色试剂，以1:1或1:2的比率混合进行，染色的时间约为3分钟到5分钟；染色后的样本再涂敷在载玻片上进行涂片后观察。由于采用等渗的离子浓度环境，该方法对核酸物质含量比较丰富的网织红细胞染色效果较好，但是染色需要的时间比较长，且不同网织红细胞比值需要计数不同红细胞数，手工计数复杂且繁琐，这种耗时、繁琐的标准方法对临床检测是一大挑战。

4、专利公开号为“cn 116413110 a”名称为“网织红细胞染色试剂组，盒以及网织红细胞染色方法”中，提供了一种在细胞悬浮状态下的进行细胞染色的染色试剂，该试剂是两步染色法(含两种独立的液体试剂)，先将样本加入染色试剂a，等待m秒(m秒大于等于20秒)，再加入稳定试剂b，混匀后形成染色混合液体再进行观察，该方法直接对血液细胞悬浮液染色，且不破坏红细胞，对网织红细胞进行计数，受稀释倍数的限制(血液约稀释50-100倍)，该方法计数的网织红细胞数量有限且染色效果一般，对内容物含量较少的网织红细胞染色效果较差，对网织红细胞的漏识别率高。

技术实现思路

1、针对现有技术中网织红细胞染色时间长且染色不够充分的问题，本发明提供了一种快速网织红细胞染色试剂及其应用，本发明的目的在于提供一种稳定性好、染色效率高、分类特征明显、仅用一种液体试剂就能对网织红细胞进行快速染色的方法，且不受稀释倍数的限制，该试剂能裂解绝大部分正常红细胞，网织红细胞的特征突出；使其能够适用于基于机器视觉原理、以细胞形态学分析技术对样品中网织红细胞进行自动识别与分类计数，保证检测结果的准确性；红细胞无需固定洗脱处于悬浮状态下的一种染色方法，能在明场实现对网织红细胞的识别。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种快速网织红细胞染色试剂，试剂成分中包含有染色剂、调节盐、穿膜剂、防腐剂、固定剂。

4、各成分作用具体如下：

5、染色剂在液体状态下通过膜上的孔迅速进入网织红细胞，与胞质内嗜碱性物质结合而使其着色；

6、调节盐用于调节试剂的渗透压，为染色提供适宜的ph环境，使染料更易进入细胞；

7、穿膜剂在红细胞细胞膜上打孔，因正常红细胞染料进入也不会着色，没有能被上色的内容物，受低渗透压的影响，正常红细胞会被完全破坏，因网织红细胞较正常红细胞内容物多，且溶液内有固定剂成分，网织红细胞以及白细胞不会被完全破坏且能保持一定形态；因穿膜剂的存在，样本与试剂混合均匀后即可上色，较其他染色方法明显缩短了染色时间；

8、固定剂一定程度能使细胞在保持细胞的完整形态；

9、防腐剂则使试剂能够长久保存。

10、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

11、一种快速网织红细胞染色试剂，包括调节盐、穿膜剂、固定剂、抗凝剂、防腐剂、染色剂，染色24h后细胞形态仍如即时染色的效果，不会褪色或者染色程度加深导致无法辨别；

12、试剂中各成分和浓度为如下：

13、调节盐，选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种，浓度为0.01-0.1m，ph为7.0-8.0；调节盐中还添加nacl或kcl，浓度为0.01-2g/l；

14、穿膜剂，选自洋地黄皂苷、皂苷，或者tritonx-100，np-40和brij-58非离子型表面活性剂中的一种，穿膜剂浓度为2-6g/l；

15、固定剂，选自海藻糖，浓度为10-20g/l；

16、抗凝剂，选自edta盐，包括edta2k、edta3k、edta2na中的一种，浓度为2-10mm；

17、防腐剂，选自proclin950或proclin300；

18、染色剂，选自新亚甲蓝、灿烂甲酚蓝等核酸结合染料中的一种，浓度为0.1-0.5g/l；

19、所述的快速网织红细胞染色试剂的配制方法：

20、依次称取调节盐、穿膜剂、固定剂、抗凝剂、防腐剂置于烧杯中，加入超纯水，最后加入染色剂搅拌至完全溶解，过滤后即可使用。

21、进一步的，试剂中：

22、调节盐选自na2hpo4、kh2po4组成的磷酸盐缓冲液，其中添加nacl；

23、通透剂选自tritonx-100；

24、固定剂选自海藻糖；

25、抗凝剂选自edta2na；

26、防腐剂选自proclin300；

27、染色剂选自新亚甲蓝。

28、本发明还涉及上述一种快速网织红细胞染色试剂的应用，是一种用于网织红细胞计数的方法，包括以下步骤：

29、1)向试剂中加入待测血液样品，快速网织红细胞染色试剂和待测血液样品的比例为(10-15):1，无染色等待的时间，摇匀后即加入到计数板中孵育；

30、2)将孵育后的计数板送入基于机器视觉原理、以ai识别技术进行自动识别与分类计数的分析仪中，分层扫描检测获得网织红分类计数结果；

31、染色后网织红细胞的具体形态特征如下：细胞无细胞核，但胞质内能看见蓝色点状物，从而与正常红细胞与白细胞明显区分；

32、染色24h后细胞形态仍如即时染色的效果，不会褪色或者染色程度加深导致无法辨别。

33、步骤2)所述的分层扫描检测，是因为网织红细胞细胞密度较轻，在计数板上沉降时间较慢，分层扫描可解决这一问题。

34、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

35、1、本发明所述的一种快速网织红细胞染色试剂，固定剂不能从现有的甲醛、多聚甲醛或戊二醛等常规固定剂中选择，现有的这些固定剂会导致红细胞的破膜效果变差，影响仪器识别。本技术选择海藻糖，因为海藻糖能够在实验条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏；本发明使用的两种染料均不具备亲脂性，透过磷脂双分子层的效率极低，创新性的配合穿膜剂和固定剂使用，可以溶解部分磷脂双分子层，使染料进入细胞的效率大幅提高，同时胞内物质不会外流，即使核酸物质含量少的网织红细胞也能被检测到；本技术使用的固定剂使磷脂双分子层不被穿膜剂完全裂解导致细胞破裂，染色24h后细胞形态仍如即时染色的效果，不会褪色或者染色程度加深导致无法辨别。

36、2、本发明所述的一种快速网织红细胞染色试剂，操作简便，一步上色；无染色等待时间，样本与试剂混合后即可上色；合适的固定剂，提高染色效率的同时，目标细胞保留染色特征。

37、3、本发明所述的一种快速网织红细胞染色试剂，破坏正常红细胞，仅计数网织红细胞，网织红细胞密度高，计算准确。