冻存保护剂及其制备方法和应用以及皮肤的冻存方法

本发明属于冻存剂领域，具体涉及一种冻存保护剂及其制备方法和应用以及皮肤的冻存方法。

背景技术：

1、皮肤是人体最大的器官，在提供机械支撑的同时，也是人体抵御环境因素的重要保护屏障。然而，这种屏障的完整性经常受到各种形式的损伤，如热烧伤、创伤性损伤和压疮。美国每年约有48.6万名患者接受皮肤烧伤治疗，费用近20亿美元。皮肤移植在再生医学中发挥着关键作用，为严重皮肤损伤提供了重要的解决方案，其也是复杂器官移植的前导干预措施。自体裂厚皮肤移植被认为是大面积烧伤和全层皮肤损伤的金标准治疗方法。然而，由于患者皮肤的稀缺性和继发性伤害的可能性增加，异体皮肤移植逐渐成为首选的治疗方案。然而，稀缺的供体皮肤成为其在临床应用中的巨大障碍。许多皮肤移植物由于不能长期保存而被丢弃，导致移植为存活力降低。离体皮肤移植物可能在最初24小时内失去高达50％的活力。因此，迫切需要开发可靠有效的离体皮肤保存策略来减轻移植物损伤。

2、低温保存是组织器官长期保存最有效的技术。包括意大利、以色列、印度和日本在内的许多国家已经通过冷冻保存技术建立了皮肤库。这使得供体皮肤移植物可以在-80℃的超低温冰箱或液氮容器中储存，以获得最佳的长期保存条件。然而，冷冻和解冻过程会导致冰晶的形成和生长，这对皮肤的结构完整性和生物力学性能构成重大威胁。移植后，冷冻保存的皮肤在感觉神经再生方面受损，表现出不均匀的色素沉着和缺乏毛囊再生。如何有效地保存皮肤原有的生理功能和结构完整性仍然是一个挑战。

3、目前，15wt％的甘油(gly)和15wt％的二甲基亚砜(dmso)通常被用作皮肤和细胞冷冻保存的冻存保护剂。然而，当使用浓度超过2wt％时，dmso会引起细胞损伤甚至遗传变化。此外，gly有限的洗脱能力限制了其在皮肤保存领域的应用。因此，研究替代传统小分子冻存保护剂的策略具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，提供一种冻存保护剂及其制备方法和应用以及皮肤的冻存方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种冻存保护剂，包括抗冻剂以及平衡液；所述的抗冻剂为甜菜碱与海藻糖的混合物。

4、所述的甜菜碱在冻存保护剂中的质量占比为8-12％；优选为10％；所述的海藻糖在所述的冻存保护剂中的质量占比为3-7％；优选为5％。

5、所述的平衡液为pbs缓冲液、dpbs缓冲液或者生理盐水中的一种。

6、本发明还包括一种所述的冻存保护剂的制备方法，包括下述步骤：将抗冻剂加入平衡液中，配置成一定浓度的冻存保护剂；优选的，抗冻剂的质量浓度为10-20％；优选为15％。

7、本发明还包括一种所述的冻存保护剂应用，应用于组织或者器官的冻存，优选的，所述的器官为皮肤。

8、本发明还包括一种皮肤的冻存方法，包括下述步骤：

9、(1)将冻存保护剂，放在冰箱预冷；

10、(2)将离体皮肤，放置于冻存袋中，加入适量步骤(1)制得的冻存保护剂，并放置于冰箱平衡，优选的，平衡1-3h；更优选为平衡2h；至渗透压平衡，使其均匀传质；

11、(3)将冻存袋放入程序控温仪中，在4℃下平衡，以0.5-5℃/min的速率降温至-80℃，并平衡，随后转移到液氮中冻存；

12、(4)复温，至冰晶融化立刻取出，用生理盐水冲洗冻存保护剂。

13、优选的，步骤(4)中复温的方式为将冻存袋浸没于37℃水浴中并不断摇晃。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

15、控制和抑制冰的形成是减轻皮肤低温保存过程中损伤的关键方面。抗冻剂中抑制冰晶生长的作用主要基于其抗冻分子结构和化学性质，甜菜碱由于其分子两端带相反电荷，整体呈现电中性的独特结构特性，使其通过静电相互总用与水分子形成较强的结合能，抑制水分子规整排布进行结冰，因此抑制冰成核；而海藻糖由于其周围多羟基的结构，能够与冰经有效的结合，阻止水分子向冰晶界面上的扩散，从而抑制冰晶的生长。

16、基于此，本发明甜菜碱以及海藻糖的加入调控冰晶的形成与生长降低皮肤冻存过程中的冰晶产生的机械损伤、由相变引起的应力激增与应力积累，对皮肤的结构完整性与生物力学系能进行保存，进一步提升皮肤移植物的冷冻保存效率。

17、1)本发明避免使用毒性高，难洗脱的传统冻存保护剂，开发了一种具有优异生物相容性、有效的抑冰性能、降低冻存热应力积累和保持纤维良好结构的冷冻保护剂，针对于皮肤深低温冻存。其基本成分为甜菜碱、海藻糖和平衡液。其中，甜菜碱是一种生物相容性良好的、渗透性小分子，其具有优异的渗透压调节能力，在提升保护剂传质效果有明显优势；此外，由于其分子两端带相反电荷，整体呈现电中性的特性，使其与水分子的结合能力较强，具有调控冰晶的能力，其能有效抑制冰核的形成，使冰核优先在保护剂中成冰而非在皮肤于保护剂界面处，避免冰晶对皮肤纤维造成损伤。海藻糖是一种非渗透性冷冻保护剂，由于其多羟基的结构，能够与磷脂双分子层形成强有力的氢键，从而稳定细胞膜、蛋白质等生物大分子结构，保护细胞质基质结构完整性。

18、2)本发明对所述冻存保护剂的冰成核、冰生长以及冰晶重结晶能力等进行了测定，并比较了传统小分子冻存保护剂的抑冰效果，综合优化出冻存保护剂配方。具体来说甜菜碱的质量浓度考察了从8％-12％，海藻糖的质量浓度考察了从3％-7％。发现甜菜碱浓度为8％、海藻糖浓度为7％时，体系所形成的非冻结水含量较少，随甜菜碱浓度增加、海藻糖浓度降低非冻结水含量逐渐增加，说明该保护剂与水结合抑制成冰；当甜菜碱浓度为10％、海藻糖浓度为5％时，对冰晶生长的抑制作用最大；该冻存保护剂中随甜菜碱比例增加，对冰晶重结晶的抑制作用增强；且与相同浓度的gly和dmso相比，该保护剂的抑冰效果均高于它们。综合考虑，甜菜碱与海藻糖的最优化质量浓度分别为10％与5％。

19、3)本发明利用上述冷冻保护剂将皮肤在液氮中冷冻保存六个月，结果发现，皮肤仍表现出完整的组织结构、良好的活力和生物力学性能，并且其效果优于使用传统冷冻保护剂gly与dmso冻存1个月。

20、综上所述，本发明为了解决现有冻存保护剂毒性高、难洗脱、生物相容性不好以及在器官冻存过程中存在应力积累与冰晶损伤的问题，基于生物相容性良好的两性离子甜菜碱与海藻糖，开发了一种生物相容性良好、有效抑制冰核的形成和生长的冻存保护剂配方。本发明首次探究了该冻存保护剂对冰晶的调控能力，并成功应用于皮肤的深低温冷冻保存。其中，甜菜碱由于其分子两端带相反电荷，整体呈现电中性的特性，使其主要通过静电相互总用与水分子形成较强的结合能力，抑制水分子的规整排列，其能有效抑制冰核的形成，具有调控冰晶的能力，使冰核优先在保护剂中成冰而非在皮肤于保护剂界面处，避免冰晶对皮肤纤维造成损伤；此外，海藻糖由于其多羟基的结构，能够与磷脂双分子层形成强有力的氢键，从而稳定细胞膜、蛋白质等生物大分子结构，保护细胞质基质结构完整性。本发明首次通过调控甜菜碱与海藻糖的控冰能力开发了一种深低温冻存保护剂应用于皮肤冻存，为实现离体皮肤长期高效的保存提供了可能。