一种用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液及其制备方法。

背景技术：

1、潜在的临床应用需要大量的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stemcells，ipscs)作为治疗性细胞(109-1010)，其通过从主细胞库或工作细胞库中解冻和培养ipscs而制备。在这一过程中，大规模细胞库(4×109)的质量影响了ipscs解冻后的扩增和随后的谱系特异性分化的效率。因此，在细胞库建设中，一个稳健和高效的深低温(例如-196℃液氮环境)保存过程成为ipscs制备的关键一步。

2、传统的ipscs深低温保存技术中，包括玻璃化或慢冷技术等方法，虽然ipscs作为簇或贴壁细胞等显示出良好的细胞存活率，但这些方法由于可扩展性差，仅适合科研实验室少量培养，不适合工业化大规模生产。以往为了解决可扩展性，将ipscs深低温保存在rho相关激酶抑制剂(rocki)中，如y-27632分离单细胞，以提高细胞存活。然而，这些方案要求ipscs在贴附的单层培养中复苏，并且不能与大规模培养如生物反应器中的细胞扩增聚集形式契合。

3、为了提高工艺效率和可靠性，需要推动基于微载体培养中聚集的ipscs扩增和深低温保存策略的发展。与基于单细胞或贴壁细胞的深低温保存相比，大规模培养的ipscs细胞形成的聚集物的大小已被证明会影响深低温保存效率。

4、除了ipscs聚集物的大小外，冻存液的配方也是影响细胞存活和临床安全性的另一个重要参数。大规模培养如生物反应器培养的ipscs因其是聚集形式而非单细胞层，目前还没有很好的深低温保存这种聚集形式的ipscs的冻存方案，此外，现有的一些深低温保存研究使用了含血清的深低温保存配方，但含血清的配方具有病原体传播风险，且需要广泛的检测以获得潜在的临床应用。

5、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、为弥补现有技术的不足，本发明提供一种用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液及其制备方法。

2、本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，提供了一种用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液，所述冻存液包括溶剂和以所述冻存液的终体积计的如下含量的各组分：白桦脂醛4-6mm、沙苑子苷1.5-2.5mm和香草醇丁醚7-13mm。

4、第二方面，提供了一种第一方面所述的用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液的制备方法，其包括如下步骤：将所述冻存液的各组分按所需浓度配制混合即得。

5、本发明具有如下优点：

6、本发明的冻存液是没有动物血清病原体传播风险的无蛋白配方，适用于大规模培养的分解离散成小尺寸(平均直径为109±56μm)聚集形式的ipscs的深低温(例如-196℃液氮环境)保存，尤其适用于大规模培养的分解离散成小尺寸聚集形式的尿液来源ipscs的深低温保存。本发明的冻存液为大规模培养的分解离散成小尺寸聚集形式的尿液来源ipscs提供了有效的保存方案，可明显促进复苏后ipscs的恢复，且无蛋白配方的冻存液最大限度降低了含动物血清的冻存液配方作为潜在临床应用时的病原体传播风险和所需的广泛的检测。本发明开发的冻存液可在ipscs深低温保存大规模ipscs库中发挥重要作用。

技术特征：

1.一种用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括溶剂和以所述冻存液的终体积计的如下含量的各组分：白桦脂醛4-6mm、沙苑子苷1.5-2.5mm和香草醇丁醚7-13mm。

2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于：所述溶剂为dmso。

3.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于：所述冻存液中，所述溶剂的体积分数为80％(v/v)。

4.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于：所述冻存液包括以所述冻存液的终体积计的如下含量的各组分：白桦脂醛5mm、沙苑子苷2mm和香草醇丁醚10mm。

5.权利要求1-4任一项所述的用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述冻存液的各组分按所需浓度配制混合即得。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述白桦脂醛母液是用dmso配制的，于-20℃下保存备用，在步骤s4中，用dmso稀释成所需浓度。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述沙苑子苷母液是用dmso配制的，于-20℃下保存备用，在步骤s4中，用dmso稀释成所需浓度。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述香草醇丁醚母液是用dmso配制的，于25℃下保存备用，在步骤s4中，用dmso稀释成所需浓度。

技术总结本发明公开了一种用于大规模培养的诱导性多能干细胞的冻存液及其制备方法，所述冻存液包括溶剂和以所述冻存液的终体积计的如下含量的各组分：白桦脂醛4‑6mM、沙苑子苷1.5‑2.5mM和香草醇丁醚7‑13mM。本发明的冻存液为大规模培养的分解离散成小尺寸聚集形式的尿液来源iPSCs提供了有效的保存方案。技术研发人员：刘佳受保护的技术使用者：深圳市中佳生物医疗科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4