NO供体型取代香豆素-呋咱偶联物与抗肿瘤活性

本发明属化学制药领域，具体涉及3，4，8-位含不同取代基的香豆素衍生物-呋咱偶联物及其水溶性、抗肿瘤活性、一氧化氮释放和细胞铁死亡药理机制等内容。

背景技术：

1、一氧化氮(nitric oxide，no)是一种重要的信号分子，可以参与多种生理功能的调节，也可以影响肿瘤细胞的生长、增殖和转移过程。研究表明，低浓度的no(小于100nm)能通过sgc的亚硝化，促进cgmp的生成，诱导肿瘤细胞周围产生新血管，并促使肿瘤细胞生长及转移。而高浓度的no(大于500nm)在肿瘤细胞内能够产生多种具有亚硝基化和硝基化能力的活性氮氧化物，通过dna损伤，阻滞细胞周期，降解抗凋亡蛋白等方式诱导肿瘤细胞死亡。

2、近年来，呋咱衍生物在抗肿瘤领域的研究越来越多，呋咱类no供体成为研究的热门之一。有文献报道了一系列呋咱氮氧化物与抗肿瘤药物的偶联化合物及其活性，如xu课题组通过将β-榄香烯与呋咱氮氧化物进行杂交得到偶联物，对恶性脑胶质瘤细胞具有显著的抗增殖作用，能明显抑制小鼠脑胶质瘤的生长，抑制率高达90％以上(eurjmed chem,2017,135:414-423.)。此外，liu课题组通过将微管干扰剂(penstatin)与苯磺酰基呋咱氮氧化物杂合，得到penstatin-呋咱化合物，对卵巢癌敏感细胞(a2780)和耐紫杉醇卵巢癌细胞(a2780/t)均表现出显著的抗增殖活性，其ic50值为0.008-0.021μm(eurj med chem,2022,230:114112.)。以及，chen课题组将多种no供体类化合物引入到二氢卟吩(e6)的骨架中得到chlorin e6-呋咱杂合物，可提高细胞内活性氧ros和no水平，具有良好的协同抗肿瘤活性(chem soc rev,2016,45(23):6488-6519.)。

3、近期，本技术发明人对先导化合物cy-16s-4a93再优化，得到28个新3，4，8-位含不同取代基的香豆素衍生物与呋咱的偶联物，部分化合物的水溶性比cy-16s-4a93增加了8-10倍。药理实验表明，大部分化合物对p-gp过表达的耐阿霉素乳腺癌细胞株mcf-7/adr的抗肿瘤活性显著高于其敏感株mcf-7。超过半数的目标化合物表现出与cy-16s-4a93类似的选择性，即对乳腺癌耐药株mcf-7/adr显示出更高的选择性抑制活性。其中活性较好的化合物13a、13c和6o对mcf-7/adr细胞的抗增殖活性比mcf-7细胞提高了1065、615和431倍，优于cy-16s-4a93的405倍。

4、此外，大部分目标化合物对4株敏感型肺癌细胞株a549、h1299、h2030和h1975及2株耐药型肺癌细胞株a549/t和a549/cddp细胞增殖具有显著抑制活性，ic50值小于50nm。此类新目标化合物(6a、6e、6j、6n、6o、6q、6s、13b-d、18c和24)在a549细胞内均能释放一定浓度的no，其中12个目标化合物(6a、6e、6j、6n、6o、6q、6s、13b-d、18c和24)的一氧化氮释放量高于先导化合物cy-16s-4a93(6.37μm)，且no的释放与抗肿瘤增殖活性有密切相关性。初步药理实验表明，化合物6o对a549和a549/cddp细胞的抑制活性与铁死亡抑制剂(fer-1)呈浓度依赖关系。同时，6o可引起细胞内活性氧ros水平升高和脂质过氧化物mda堆积，存在通过铁死亡途径使细胞死亡的相关药理机制。此外，6o还能诱导a549和a549/cddp细胞凋亡，暗示该类香豆素-呋咱偶联物具有通过铁死亡、诱导凋亡等多途径抑制非小细胞肺癌细胞增殖作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供活性明确、水溶性改善，对p-gp过表达的mdr肿瘤耐药株有高选择性抑制作用以及能通过铁死亡、诱导凋亡等多途径抑制非小细胞肺癌细胞增殖作用的新型抗肿瘤化合物。具体涉及化合物4-(2-((3-(3，5-二氯苄基)-4-甲基-2-氧代-2h-色烯-7-氧基)乙氧基)-3-(苯磺酰基)-1,2,5-噁二唑2-氧化物(cy-20s-3a72，6o)及其衍生物和抑制肿瘤生长活性的应用。

2、本发明以原有活性化合物cy-16s-4a93为基础，设计合成如图1所示的，对mcf-7/adr、a549、h1299、h2030、h1975、a549/t以及a549/cddp肿瘤细胞增殖具有显著抑制活性的香豆素3，4，8-位含不同取代基的香豆素衍生物与呋咱偶联的化合物。

3、本发明中，优选的香豆素呋咱偶联物具有式i的结构，所述的取代香豆素衍生物与呋咱的偶联物，为香豆素母核3-位连接含邻、间、对不同取代基的苄基和取代苯乙基；4-位连接烷基、无取代芳基和取代芳基；8-位连接取代芳基烷酸酯基甲基；再在7-位通过两碳边链与呋咱氮氧化物偶联合成的i式中的产物。(如图1所示)，

4、其中：r1为甲基、乙基、丙基、苯基、三氟甲基苯基

5、r2为邻、间、对-甲氧基苄基；邻、间、对-胺基苄基；邻、间、对-氯苄基；邻、间-三氟甲基苄基；对溴苄基；间-氰基苄基；3，5-二甲氧基苄基；3，4，5-三甲氧基苄基；3，5-二甲三氟甲基苄基；3，4-二氯苄基；2，6-二氯苄基；3，5-二氯苄基；3-氯-4-氟苄基；3-氟-4-氯苄基；3-氟-5-氯苄基；4-胺基苯乙基r3为3，4，5-三甲氧基苯乙酰氧亚甲基

6、本发明提供了所述的香豆素母核的呋咱偶联物的制备方法，其包括：

7、干燥thf中加入60％氢化钠，冰浴下滴加乙酰乙酸乙酯和2a-s，亲核取代反应得到乙酰乙酸乙酯衍生物3a-s；进一步在70％硫酸下与间苯二酚环合反应得到3-取代的香豆素母核产物4a-s；然后与溴乙醇、碳酸钾和碘化钠在dmf中回流反应得到7-羟乙氧基-香豆素衍生物5a-s；最后和苯磺酰基呋咱氮氧化物在含dbu的二氯甲烷中，室温反应合成目标衍生物6a-s。化学反应如下通式一：

8、通式一，

9、

10、干燥thf中加入60％氢化钠，冰浴下滴加乙酰乙酸乙酯和2t-w，亲核取代反应得到乙酰乙酸乙酯衍生物7a-d；进一步在70％硫酸下与间苯二酚环合反应得到3-取代的香豆素母核产物8a-d；然后与溴乙醇、碳酸钾和碘化钠在dmf中回流反应得到7-羟乙氧基-香豆素衍生物9a-d；之后与二水合氯化亚锡在dcm中得到还原产物10a-d；还原产物10a-d与三乙胺和碳酸酐二叔丁酯在dcm中加热反应得到3位boc保护的香豆素母核产物11a-d；然后和苯磺酰基呋咱氮氧化物在含dbu的二氯甲烷中，室温反应合成12a-d；最后和20％三氟乙酸在dcm中，室温反应合成3-位含氨基取代目标衍生物13a-d。化学反应如下通式二：

11、通式二，

12、

13、干燥thf中加入60％氢化钠，冰浴下滴加乙酰乙酸乙酯衍生物(14a-d)和3-氯-4-氟苄溴，亲核取代反应得到15a-d；进一步在70％硫酸下与间苯二酚环合反应得到3-取代的香豆素母核产物16a-d；然后与溴乙醇、碳酸钾和碘化钠在dmf中回流反应得到7-羟乙氧基-香豆素衍生物17a-d；最后和苯磺酰基呋咱氮氧化物在含dbu的二氯甲烷中，室温反应合成目标衍生物18a-d。化学反应如下通式三：

14、通式三，

15、

16、冰醋酸中加入7-羟基-4-甲基香豆素和乌洛托品，升温反应；待第一步反应基本完全，降温至70℃，加入5n盐酸继续反应生成8-醛基-4-甲基香豆素衍生物20；进一步在dmf中与溴乙醇、碳酸钾和碘化钠回流反应得到7-羟乙氧基-香豆素衍生物21；之后和苯磺酰基呋咱氮氧化物在含dbu的二氯甲烷中，室温反应合成香豆素呋咱衍生物22；然后冰浴下在meoh中与硼氢化钠室温反应得8-羟基香豆素呋咱衍生物23；最后与3，4，5-三甲氧基苯乙酸、edci和dmap在二氯甲烷中，室温反应合成目标衍生物24。反应如下通式四：

17、通式四，

18、

19、本发明所述的3，4，8-位含不同取代基的香豆素母核通过两碳链接与呋咱氮氧化物偶联的呋咱衍生物(6a-s、13a-d、18a-d和24)，进行了溶解度检测和细胞水平的抗肿瘤活性筛选。目标化合物在pbs(ph＝7.4)中的溶解度实验结果显示，此类化合物(13a-d)的水溶性比原活性化合物cy-16s-4a93增加了8-10倍。

20、在体外药理实验，以先导化合物cy-16s-4a93作为对照，测定了28个目标化合物对mcf-7(人乳腺癌细胞)和mcf-7/adr(阿霉素耐药的人乳腺癌细胞)的抗肿瘤活性。比较目标化合物在敏感株mcf-7及耐药株mcf-7/adr的抗增殖活性抑制率，绝大部分目标化合物都保留了与先导化合物cy-16s-4a93类似的选择性，即对乳腺癌耐药株mcf-7/adr显示出更高的抑制活性，也就是“附属敏感性”。其中，化合物13a、13c及6o对乳腺癌耐药细胞mcf-7/adr的细胞增殖抑制作用，比对敏感细胞mcf-7抗增殖活性提高了1065、615和431倍。

21、接着，以化合物cy-16s-4a93、顺铂(cisplatin,cddp)和紫杉醇(paclitaxel,ptx)为阳性对照，测定目标化合物对非小细胞肺癌敏感细胞株(a549、h1299、h2030和h1975)和非小细胞肺癌耐药细胞株(a549/t和a549/cddp)的增殖抑制率。实验结果显示，大部分目标化合物对六株非小细胞肺癌都有良好的抗增殖活性，并且目标化合物对非小细胞肺癌敏感细胞株(h1299、h2030、h1975和a549)的增殖抑制活性优于对耐药株(a549/t和a549/cddp)的增殖抑制活性。

22、此外，24个目标化合物在a549细胞内均能释放一定浓度的no，抗肿瘤活性与no清除剂呈浓度依赖负相关结果，说明这类化合物抗肿瘤活性与释放有效no浓度有关。

23、初步药理实验表明，化合物6o对a549和a549/cddp细胞的抑制活性与铁死亡抑制剂(fer-1)呈浓度依赖关系；同时，6o可引起细胞内活性氧ros水平升高和脂质过氧化物mda堆积。此外，6o还能诱导a549和a549/cddp细胞凋亡。

24、本发明中通过下述方法检测所述化合物的溶解度和进行生物活性研究。

25、1.首先制作标准曲线，确定曲线下面积和溶解度的关系，然后用hplc检测每个化合物曲线下面积并计算溶解度。

26、2.使用mts法敏感和耐药实体肿瘤细胞细胞毒测定，设置空白对照组、目标化合物(6a-h、6j-k、6n-q、6s、13a-d、18a-d和24)、化合物cy-16s-4a93、阳性药(顺铂和紫杉醇)对照组，加药后37℃培养48小时，进行mts检测并计算抑制率和ic50值。受试肿瘤细胞株：人乳腺癌细胞(mcf-7)、阿霉素耐药的人乳腺癌细胞(mcf-7/adr)、非小细胞肺癌敏感细胞株(a549、h1299、h2030和h1975)和非小细胞肺癌耐药细胞株(a549/t和a549/cddp)。

27、3.采用经典griess试剂原理，用“总no检测试剂盒(beyotime)”检测目标化合物在肿瘤细胞a549内的一氧化氮释放水平。

28、4.使用活性氧检测试剂盒(reactive oxygen species assay kit,beyotime)和脂质氧化物丙二醛(mda)检测试剂盒(lipid peroxidation mdaassay kit,beyotime)，检测a549和a549/cddp细胞中ros和mda含量的变化。

29、5.使用annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒(annexin v-fitc apoptosisdetection kit,beyotime)和bd fascscalibur流式细胞仪检测化合物6o在a549和a549/cddp细胞内诱导细胞凋亡。

30、本发明所述的28个香豆素-呋咱偶联物结构新颖，溶解度得以改善，具有高选择性抑制p-gp过表达耐药肿瘤细胞增殖活性的作用，以及能通过铁死亡、诱导凋亡等多途径抑制非小细胞肺癌细胞增殖作用的新型抗肿瘤化合物，这为后续深入研究寻找具有多途径抑癌药理机制，克服乳腺癌、非小细胞肺癌等的多药耐药的新药奠定了基础。