苯丙氨酸裂解酶突变体及其偶联物或其药学上可接受的盐的制作方法

本发明属于生物制药，具体地，本发明涉及一种苯丙氨酸裂解酶突变体及其偶联物或其药学上可接受的盐，更具体地，本发明涉及一种苯丙氨酸裂解酶突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐、聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体、药物组合物及其用途和降低苯丙氨酸裂解酶免疫原性同时保持苯丙氨酸裂解酶酶活的方法。

背景技术：

1、苯丙酮尿症(phenylketonuria,pku，又称为苯丙氨酸羟化酶缺乏症)是由肝脏内苯丙氨酸羟化酶缺乏或活性降低而引起的苯丙氨酸代谢障碍疾病，是一种隐性遗传疾病。苯丙氨酸是人体必需氨基酸，参与多种生理活动，但人体不能合成，须由食物摄入。正常情况下，摄入的苯丙氨酸除用于合成各种蛋白外，其余部分在苯丙氨酸羟化酶的作用下转变为酪氨酸，再经其它酶作用转化为多巴、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素或黑色素等。苯丙酮尿症患者因体内苯丙氨酸羟化酶(pah)缺乏或活性降低，不能有效降解苯丙氨酸，一方面造成患者血浆内苯丙氨酸蓄积，当血浆中苯丙氨酸浓度超过肾阀值后通过尿液排出体外，产生苯丙氨酸尿；另一方面，蓄积的苯丙氨酸通过其它次代谢途径生成苯丙酮酸、苯乳酸等对大脑及其它神经系统有毒害作用的物质。

2、该病属于隐性遗传疾病，患儿出生后由于缺乏苯丙氨酸羟化酶(pah)活性，无法有效降解哺乳或饮食产生的苯丙氨酸，造成体内苯丙酮酸等对神经系统有毒害作用物质的蓄积，进而影响大脑等神经系统的发育，随年龄的增长而出现严重智力损伤，同时伴随其它异常行为，如癫痫等。肝脏中pah的活性受损导致的苯丙氨酸代谢障碍，会导致苯丙酮尿症(pku)和高苯丙氨酸血症(hpa)，表现出神经生理功能受损和认知发展下降的现象。如孕妇为苯丙酮尿症患者，则患儿在母体内即开始出现神经系统损伤。

3、目前针对苯丙酮尿的治疗主要有饮食控制疗法、bh4(四氢生物喋呤)替代疗法和药物疗法等3种。

4、饮食控制疗法通过降低患者饮食中苯丙氨酸的含量来减少血浆内苯丙氨酸及苯丙酮等的蓄积，同时辅助以5-羟色胺、l-多巴胺治疗。该方法虽对病症有所控制，但长期坚持患者的依顺性和生活质量难以得到保障，且不能消除由苯丙氨酸水平升高引起的受损的神经学效应，怀孕期间的饮食控制同样可能导致胎儿先天缺陷，患儿饮食治疗期间一些营养物质的缺乏，对于脑发育同样有害。

5、bh4替代疗法通过服用生理剂量的bh4来降低体内苯丙氨酸的浓度，但并非对所有患者有效。目前，用于治疗苯丙酮尿症的此类药物仅有biomarin公司和日本三得利公司(suntory)公司上市的两种药物，但均针对异型高苯丙酸血症(即二氢喋呤还原酶或合成酶缺失引起的高苯丙酸血症)，而无法治疗苯丙氨酸羟化酶缺乏导致的苯丙酮尿症。

6、因此，亟需开发一种可有效治疗苯丙酮尿症等高苯丙氨酸相关性疾病的药物。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物，该偶联物具有免疫原性低和体内半衰期长等优点，可用于预防和治疗苯丙酮尿症等高苯丙氨酸相关性疾病。

2、本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

3、苯丙氨酸裂解酶是一种广泛存在于植物中的非哺乳动物酶(如圆红冬酵母、深红酵母、马铃薯、小麦、地衣、链霉菌、多变鱼腥藻等)，其活性形式为同源四聚体，可将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸和氨，并进一步代谢为马尿酸从尿液中排除体外。早在20世纪90年代末，已有研究者将圆红冬酵母来源的苯丙氨酸裂解酶进行小鼠皮下注射或口服降低其血浆中苯丙氨酸水平，但受限于微生物或植物来源的苯丙氨酸裂解酶进入人体后会因免疫反应而很快失效，且在人体不稳定，易受到蛋白水解酶的降解而失去活性。

4、在pku模型小鼠治疗试验中，来源于圆红冬酵母的r.h.pal、斑点球藻的n.p.pal、凤藻的p.c.pal和多变鱼腥藻的a.v.pal等四种不同来源的野生型pal蛋白被用于测试，r.h.pal和a.v.pal及其聚乙二醇化偶联物因具有最高的酶比活性以及在最适反应ph、km参数、蛋白酶抗性和热稳定性方面的优势，被认为更适合用于pku小鼠的治疗，推测这可能与其野生型序列所携带的氨基酸数量和分子性状有关。

5、目前，上市聚乙二醇化苯丙氨酸裂解酶药物pegvaliase的iii期临床研究结果显示，在接受聚乙二醇化苯丙氨酸裂解酶治疗的261名受试者中，72.0％和32.6％分别达到了≥12个月和≥24个月的研究终点，65％的受试者仍在接受治疗。在24个月内，68.4％的参与者达到血液phe≤600μmol/l，60.7％的参与者达到血液phe≤360μmol/l，和51.2％达到血液phe≤120μmol/l。给药期间，血清中苯丙氨酸含量暂时得到了有效控制，但随给药次数增加，anti-pal igm/igg抗体滴度逐步升高，由此引起的血药清除，使得必须不断提高给药剂量和给药频率以维持药效。

6、然而，在本发明的一个方面，本发明提出了一种苯丙氨酸裂解酶突变体。根据本发明的实施例，与苯丙氨酸裂解酶的氨基酸序列相比，所述苯丙氨酸裂解酶突变体具有如下位点的突变：第72位、第240位、第467位和第544位中的至少之一。本发明通过对苯丙氨酸裂解酶的上述特定位点进行突变，得到的苯丙氨酸裂解酶突变体通过聚乙二醇修饰后，既可提高聚乙二醇的平均修饰度，还可提高酶活保留率，且可降低免疫原性以及将血药维持至5～7天。

7、在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，编码前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。根据本发明实施例的核酸分子所编码前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。

8、在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体可有效实现前述的苯丙氨酸裂解酶突变体的表达，进而实现苯丙氨酸裂解酶突变体的体外大量获得。

9、在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。

10、在本发明的又一方面，本发明提出了一种苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐。根据本发明的实施例，所述苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐包括：前述的苯丙氨酸裂解酶突变体；修饰基团，所述修饰基团与所述苯丙氨酸裂解酶突变体相连。本发明的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐具有聚乙二醇的平均修饰度高、酶活保留率高、免疫原性低和血药维持时间长等优点。

11、在本发明的又一方面，本发明提出了一种聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体。根据本发明的实施例，所述苯丙氨酸裂解酶突变体中至少下列氨基酸位点具有peg修饰：k72、k240、k467和k544。本发明的聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体具有平均修饰度高、酶活保留率高、免疫原性低和血药维持时间长等优点。

12、在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前述的苯丙氨酸裂解酶突变体或前述的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐。本发明的药物组合物可有效预防和/或治疗高苯丙氨酸相关性疾病，尤其是治疗苯丙酮尿症。

13、在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的苯丙氨酸裂解酶突变体、前述的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐、前述的聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体或前述的药物组合物在制备药物上的用途，所述药物用于预防和/或治疗高苯丙氨酸相关性疾病。

14、在本发明的又一方面，本发明提出了一种降低苯丙氨酸裂解酶免疫原性同时保持苯丙氨酸裂解酶酶活的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将突变后的所述苯丙氨酸裂解酶的突变位点进行peg修饰；所述突变位点包括e72k、q240k、r467k和r544k中的至少之一。本发明的方法可降低苯丙氨酸裂解酶免疫原性同时具有较高的苯丙氨酸裂解酶酶活保留率。

15、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。