用于检测分枝杆菌的引物和探针的制作方法

背景技术：

1、分枝杆菌是分枝杆菌科(mycobacteriaceae)的一部分。分枝杆菌的系统发生和命名法正在迅速发展。在2018年2月之前，分枝杆菌的所有物种都被分为单一属，即分枝杆菌属(mycobacterium)。自那时以及2018年gupta r.等人的论文发表以来，已经有超过188个分枝杆菌的物种被引用，它们被分为5个不同的属，即分枝杆菌属、拟分枝杆菌属(mycobacteroides)、分枝菌酸杆形菌属(mycolicibacterium)、分枝菌酸杆菌属(mycolicibacter)和分枝菌酸小杆菌属(mycolicibacillus)。

2、此外，最近所述命名法略有修改(参见riojas m.a.等人,2018)。现在承认，存在200个已确认的分枝杆菌物种，其中6个包含亚种或变种，因此存在217个已确认的分枝杆菌物种、亚种或变种。随后的变化修改了分枝杆菌的分类，重构了单一的分枝杆菌属，但是既没有修改被视为分枝杆菌的菌株，也没有修改它们的编号(meehan cj等人,2021)。

3、在这些不同的物种中，它们中的一些对人类具有致病性，如结核分枝杆菌(m.tuberculosis)(结核病的致病病原体)和麻风分枝杆菌(m.leprae)(麻风病的致病病原体)。

4、其他分枝杆菌，称为非结核分枝杆菌(ntm)，可能是人类的机会性病原体，与肺部感染和肺外感染(分别为鸟分枝杆菌(m.avium)和海分枝杆菌(m.marinum))有关。然而，其他物种是共生细菌。

5、分枝杆菌的生长动力学变化很大，并且比大多数其他细菌的生长动力学缓慢得多；事实上，快速生长的分枝杆菌具有大约48至72小时的生殖周期，而对于缓慢生长的物种，生殖周期可以在10天与2个月之间。作为比较，大肠杆菌(e.coli)的生长速率是20分钟。

6、分枝杆菌广泛分布于各种环境(如水和土壤)中，并且可能具有几种宿主(人类、牛、原生动物)，这使得它们的检测极具挑战性(haig等人,2018)。在生产过程期间，分枝杆菌可能通过所述过程中使用的动物或人来源的原材料(如细胞和血清)潜在地污染生物药物产品(如疫苗)。所述污染也可能是由操作人员或由环境(如水)带来的。

7、因此，在疫苗产品(尤其是非灭活病毒疫苗产品)中，以及在疫苗生产中使用的细胞库和病毒种子库中筛选分枝杆菌。

8、分枝杆菌检测是一项安全性发布测试，可能是对在真核细胞中表达或基于真核细胞的所有生物或药物产品所要求的。欧洲药典在病毒种子批次和病毒收获阶段对病毒疫苗有该要求；日本和中国药典中有同等要求；在美国也进行分枝杆菌测试，以确保药物产品的安全性。

9、欧洲药典中描述为安全性发布测试的当前方法是基于微生物培养(参见欧洲药典第2.6.2章和who的technical report series-trs 978)。需要将样品一式三份接种到两种合适的固体培养基(-jensen培养基和middlebrook 7h10培养基被视为合适的固体培养基)上和一种合适的液体培养基中。将所有培养基在36.5℃±1.5℃下孵育56天。

10、上述药典的基于培养的测定的主要问题和局限性尤其是：特定培养基的可用性和潜在短缺、获得结果的时间非常长(56天)，以及对一些分枝杆菌(如胞内分枝杆菌(m.intracellulare))的检测的缺失。通过上文提及的测试没有检测到一个重要的人类来源的物种，即麻风分枝杆菌，所述麻风分枝杆菌是一种专性细胞内寄生虫。因此，还存在与根据药典方法对该物种的检测的缺失相关的安全性风险。所述基于培养的测定也无法检测具有特定生长需求的苛养物种，如需要更长孵育时间(即，8-12周)的日内瓦分枝杆菌(m.genavense)，或需要铁培养基补充的嗜血分枝杆菌(m.haemophilum))。

11、本领域已经公开了一些替代方法，它们基于pcr(聚合酶链反应)或qpcr(定量pcr)，且靶向分枝杆菌基因组的不同区域。这些方法具有克服所述基于培养的技术的至少一些局限性的潜力，因为它们靶向细菌dna，因此应不受培养微生物的必需品的限制。

12、然而，为检测分枝杆菌而开发的基于qpcr步骤的这些替代技术中的一些与培养天数相关，因此仍然需要至少一个月才能完成。因此，这些方法没有解决药典的基于培养的测定的时间局限性，也没有解决检测胞内分枝杆菌的问题。

13、使用靶向its序列和16s序列的qpcr开发了其他方法，但基于先前的分类学分枝杆菌(2018)。这些方法通常显示缺乏灵敏度和/或敏感性，尤其是在应用于新的分类学后(2018)。

14、已经开发了基于高体积(水样)的过滤、免疫捕获和靶向hsp65基因的qpcr的另一种技术。然而，此技术不能确保足够高的灵敏度，因为根据此方法不能检测到所有分枝杆菌。

15、事实上，鉴于缺乏关于全部分枝杆菌物种的相应序列的数据，有强烈的迹象表明，现有技术中公开的方法中靶向的序列不允许分枝杆菌的详尽检测，这代表重要的安全性风险。

16、最后，这些替代方法靶向的序列大多不是分枝杆菌所特有的，使得非分枝杆菌序列也被扩增，从而产生假阳性和不可靠的结果。

17、此外，需要强调的是，本领域中公开的基于pcr的检测方法大多旨在用于诊断目的，仅检测对人类致病的分枝杆菌，使得对分枝杆菌属的详尽性甚至不是目标，并且特异性也是如此。类似地，大多数方法旨在用于检测从患者获得的可能呈现重要的分枝杆菌浓度的样品；使得未测试灵敏度，和/或灵敏度太低而与生物药物产品中污染的检测(需要在通常低于100个活分枝杆菌/ml的浓度下进行检测)不相容。

18、因此，先前的技术中没有一种提供所需的安全性、效率和稳健性，以满足安全性发布测试的要求。因此，仍然迫切需要药典方法的替代方法，所述替代方法具有提高的详尽性，并且更快速。因此，仍然迫切需要药典方法的替代方法，所述替代方法提供相同的特异性，但是具有提高的详尽性，并且是有效的、稳健的和更快速的。因此，仍然迫切需要药典方法的替代方法，所述替代方法提供相同的特异性，但是具有提高的详尽性，并且是有效的、稳健的和更快速的，并且可以与药典方法一样灵敏。

19、使用应用于新的分类学的基因组分析和生物信息学，诸位发明人出乎意料地发现了适于pcr并且检测分枝杆菌的所有已知菌株和物种的引物组合。因此，基于此组合的方法允许以详尽的方式检测样品中的分枝杆菌物种，即检测可能存在的分枝杆菌的任何物种，而不管分枝杆菌的分类如何，不管它是否是人类病原体，不管它是快速生长的还是缓慢生长的分枝杆菌，不管分枝杆菌是像在人体液样品中一样处于高浓度，还是作为污染物处于非常低的浓度。

20、此外，诸位发明人还发现了能够特异性检测分枝杆菌的所有已知菌株和物种的引物和探针的组合。因此，基于此组合的方法允许以详尽且特异性的方式特异性检测样品中的分枝杆菌物种，即检测分枝杆菌的任何物种、亚种或变种，但不检测其他细菌，尤其不检测在系统发生上接近的物种。

技术实现思路

1、本发明涉及一种用于通过聚合酶链反应(pcr)扩增样品中存在的任何分枝杆菌rrs基因的序列的引物组，其中所述组包含至少三个以下引物对：

2、第1对：

3、正向引物f1，其具有序列：5'-cctggtagtccacgccgtaa-3'(seqid no:1)或其修饰，

4、反向引物r1，其具有序列：5'-cggatcccaaggaaggaaac-3'(seqid no:2)或其修饰；

5、第2对：

6、正向引物f3，其具有序列：5'-cacaggacgccggtagagat-3'(seqid no:4)或其修饰，

7、反向引物r3，其具有序列：5'-catgcaccacctgcacaca-3'(seq id

8、no:5)或其修饰；

9、第3对：

10、正向引物f4，其具有序列：5'-cccttatgtccagggcttca-3'(seqid no:7)或其修饰，

11、反向引物r4，其具有序列：5'-ggcatcgcagccctttg-3'(seq id

12、no:8)或其修饰；

13、其中所述修饰是在3'和/或5'末端处1至4个核苷酸的添加和/或缺失，和/或1或2个核苷酸的取代，并且

14、其中所述三个引物对允许扩增来自任何分枝杆菌物种的rrs基因的序列。

15、根据特定实施方案，所述第一引物对选自：

16、1)正向引物f1-1：5'-cctggtagtccacgccgtaa-3'(seq id no:1)

17、反向引物r1-1：5'-cggatcccaaggaaggaaac-3'(seq id no:2)；

18、2)正向引物f1-1：5'-cctggtagtccacgccgtaa-3'(seq id no:1)

19、反向引物r1-6：5'-ggatcccaaggaaggaaacc-3'(seq id no:13)；

20、3)正向引物f1-1：5'-cctggtagtccacgccgtaa-3'(seq id no:1)

21、反向引物r1-5：5'-acggatcccaaggaaggaaac-3'(seq id no:12)；

22、4)正向引物f1-2：5'-cctggtagtccacgccgtaaa-3'(seq id no:10)反向引物r1-1：5'-cggatcccaaggaaggaaac-3'(seq id no:2)；

23、5)正向引物f1-2：5'-cctggtagtccacgccgtaaa-3'(seq id no:10)反向引物r1-3：5'-cacggatcccaaggaaggaaac-3'(seq id no:27)；

24、6)正向引物f1-2：5'-cctggtagtccacgccgtaaa-3'(seq id no:10)反向引物r1-5：5'-acggatcccaaggaaggaaac-3'(seq id no:12)；

25、7)正向引物f1-2：5'-cctggtagtccacgccgtaaa-3'(seq id no:10)反向引物r1-6：5'-ggatcccaaggaaggaaacc-3'(seq id no:13)；

26、以及

27、8)正向引物f1-3：5'-ctggtagtccacgccgtaaa-3'(seq id no:11)

28、反向引物r1-6：5'-ggatcccaaggaaggaaacc-3'(seq id no:13)。

29、根据特定实施方案，所述第二引物对选自：

30、1)正向引物f3-1：5'-cacaggacgccggtagagat-3'(seq id no:4)

31、反向引物r3-1：5'-catgcaccacctgcacaca-3'(seq id no:5)；

32、2)正向引物f3-3：5'-cacaggacgccggtagagata-3'(seq id no:14)

33、反向引物r3-1：5'-catgcaccacctgcacaca-3'(seq id no:5)；

34、3)正向引物f3-1：5'-cacaggacgccggtagagat-3'(seq id no:4)

35、反向引物r3-2：5'-catgcaccacctgcacacag-3'(seq id no:15)；

36、4)正向引物f3-1：5'-cacaggacgccggtagagat-3'(seq id no:4)

37、反向引物r3-3：5'-atgcaccacctgcacacag-3'(seq id no:16)；

38、5)正向引物f3-3：5'-cacaggacgccggtagagata-3'(seq id no:14)

39、反向引物r3-2：5'-catgcaccacctgcacacag-3'(seq id no:15)；

40、6)正向引物f3-3：5'-cacaggacgccggtagagata-3'(seq id no:14)

41、反向引物r3-3：5'-atgcaccacctgcacacag-3'(seq id no:16)；

42、7)正向引物f3-1：5'-cacaggacgccggtagagat-3'(seq id no:4)

43、反向引物r3-4：5'-tgcaccacctgcacacag-3'(seq id no:17)。

44、以及

45、8)正向引物f3-3：5'-cacaggacgccggtagagata-3'(seq id no:14)

46、反向引物r3-4：5'-tgcaccacctgcacacag-3'(seq id no:17)。

47、根据特定实施方案，所述第三引物对选自：

48、1)正向引物f4-1：5'-cccttatgtccagggcttca-3'(seq id no:7)、反向引物r4-1：5'-ggcatcgcagccctttg-3'(seq id no:8)；

49、2)正向引物f4-3：5'-ccccttatgtccagggcttc-3'(seq id no:18)、反向引物r4-1：5'-ggcatcgcagccctttg-3'(seq id no:8)；

50、3)正向引物f4-5：5'-gccccttatgtccagggc-3'(seq id no:19)、

51、反向引物r4-1：5'-ggcatcgcagccctttg-3'(seq id no:8)；

52、4)正向引物f4-1：5'-cccttatgtccagggcttca-3'(seq id no:7)、反向引物r4-3：5'-cggcatcgcagccctt-3'(seq id no:20)；

53、5)正向引物f4-1：5'-cccttatgtccagggcttca-3'(seq id no:7)、反向引物r4-5：5'-gcatcgcagccctttgta-3'(seq id no:28)；

54、6)正向引物f4-3：5'-ccccttatgtccagggcttc-3'(seq id no:18)、反向引物r4-3：5'-cggcatcgcagccctt-3'(seq id no:20)；

55、7)正向引物f4-5：5'-gccccttatgtccagggc-3'(seq id no:19)、

56、反向引物r4-3：5'-cggcatcgcagccctt-3'(seq id no:20)；

57、以及

58、8)正向引物f4-5：5'-gccccttatgtccagggc-3'(seq id no:19)、

59、反向引物r4-6：5'-ggcatcgcagccctttgta-3'(seq id no:21)。

60、本发明还涉及用于通过pcr扩增样品中的分枝杆菌rrs基因序列的试剂盒，所述试剂盒包含如上文定义的引物组。

61、根据一个实施方案，所述试剂盒用于检测样品中通过pcr扩增的分枝杆菌rrs基因序列，并且进一步包含用于检测一种或多种扩增产物的以下相关探针：

62、-探针s1，其具有序列5'-cggtgggtactaggtgtg-3'(seq id no:3)或其修饰，用于检测通过所述引物f1和r1扩增的序列；

63、-探针s3，其具有序列：5'-tcggttcccttgtggc-3'(seq id no:6)或其修饰，用于检测通过所述引物f3和r3扩增的序列；

64、-探针s4，其具有序列：5'-acatgctacaatggccgg-3'(seq id no:9)或其修饰，用于检测通过所述引物f4和r4扩增的序列，

65、其中所述修饰是在3'和/或5'末端处1至2个核苷酸的添加和/或缺失。

66、根据一个实施方案，所述探针选自：

67、a)对于所述探针s1，选自：

68、探针s1-0：5'-cggtgggtactaggtgtg-3'(seq id no:3)、探针s1-1：5'-cggtgggtactaggtgt-3'(seq id no:22)和

69、探针s1-2：5'-cggtgggtactaggtg-3'(seq id no:23)；

70、其中当所述探针s1是s1-1时，所述第一引物对选自：

71、1)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

72、2)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

73、3)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

74、4)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

75、以及

76、5)正向引物f1-3(seq id no:11)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

77、当所述探针s1是s1-2时，所述第一引物对选自：

78、1)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

79、2)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

80、3)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

81、4)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

82、5)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

83、以及

84、6)正向引物f1-3(seq id no:11)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

85、b)对于所述探针s3，选自：

86、探针s3-0：5'-tcggttcccttgtggc-3'(seq id no:6)、探针s3-1：5'-atcggttcccttgtggc-3'(seq id no:24)和

87、探针s3-2：5'-cggttcccttgtggc-3'(seq id no:25)；

88、其中当所述探针s3是s3-1时，所述第二引物对选自：

89、1)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

90、2)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

91、3)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

92、4)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

93、以及

94、5)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

95、当所述探针s3是s3-2时，所述第二引物对选自：

96、1)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

97、2)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

98、3)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

99、4)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

100、5)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-4(seq id no:17)；

101、以及

102、6)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

103、c)对于所述探针s4，选自：

104、探针s4-0：5'-acatgctacaatggccgg-3'(seq id no:9)和

105、探针s4-1：5'-acatgctacaatggccggt-3'(seq id no:26)；

106、其中当所述探针s4是s4-1时，所述第三引物对选自：

107、1)正向引物f4-1(seq id no:7)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

108、2)正向引物f4-3(seq id no:18)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

109、3)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

110、4)正向引物f4-1(seq id no:7)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

111、5)正向引物f4-3(seq id no:18)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

112、6)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

113、以及

114、7)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-6(seq id no:21)。

115、在一个实施方案中，所述试剂盒用于通过定量聚合酶链反应(qpcr)或通过数字聚合酶链反应(dpcr)进行扩增。

116、本发明还涉及用于扩增和检测样品中存在的任何分枝杆菌的rrs基因的序列的方法，所述方法包括同时或依序进行的以下步骤：

117、a)用上文公开的至少三个引物对的组对从所述样品中提取的核酸进行体外pcr；

118、b)检测扩增产物的存在或不存在。

119、所述扩增步骤a)可以例如通过定量pcr或数字pcr进行。

120、根据一个实施方案，所述检测步骤b)用以下相关探针进行：

121、i.探针s1，其选自：

122、探针s1-0：5'-cggtgggtactaggtgtg-3'(seq id no:3)、探针s1-1：5'-cggtgggtactaggtgt-3'(seq id no:22)和

123、探针s1-2：5'-cggtgggtactaggtg-3'(seq id no:23)；

124、其中当所述探针s1是s1-1时，所述第一引物对选自：

125、1)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

126、2)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

127、3)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

128、4)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

129、以及

130、5)正向引物f1-3(seq id no:11)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

131、当所述探针s1是s1-2时，所述第一引物对选自：

132、1)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

133、2)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

134、3)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

135、4)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

136、5)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

137、以及

138、6)正向引物f1-3(seq id no:11)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

139、ii.探针s3，其选自：

140、探针s3-0：5'-tcggttcccttgtggc-3'(seq id no:6)、探针s3-1：5'-atcggttcccttgtggc-3'(seq id no:24)和

141、探针s3-2：5'-cggttcccttgtggc-3'(seq id no:25)；

142、其中当所述探针s3是s3-1时，所述第二引物对选自：

143、1)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

144、2)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

145、3)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

146、4)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

147、以及

148、5)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

149、当所述探针s3是s3-2时，所述第二引物对选自：

150、1)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

151、2)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

152、3)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

153、4)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

154、5)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-4(seq id no:17)；

155、以及

156、6)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

157、iii.探针s4，其选自：

158、探针s4-0：5'-acatgctacaatggccgg-3'(seq id no:9)和

159、探针s4-1：5'-acatgctacaatggccggt-3'(seq id no:26)；

160、其中当所述探针s4是s4-1时，所述第三引物对选自：

161、1)正向引物f4-1(seq id no:7)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

162、2)正向引物f4-3(seq id no:18)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

163、3)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

164、4)正向引物f4-1(seq id no:7)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

165、5)正向引物f4-3(seq id no:18)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

166、6)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

167、以及

168、7)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-6(seq id no:21)。

169、所述方法可以包括在进行步骤a)之前从所述样品中提取所述核酸的初始步骤。

170、本发明还涉及一种用于在没有任何培养步骤的情况下检测药物产品中分枝杆菌污染存在的方法，所述方法包括同时进行的以下步骤：

171、a)通过定量pcr(qpcr)或dpcr，用上文所述的至少三个引物对，对从所述产品的样品中提取的核酸进行体外扩增，其中所述引物与所述rrs基因杂交，

172、b)通过以下探针来检测扩增产物的存在或不存在：

173、i.探针s1，其选自：

174、探针s1-0：5'-cggtgggtactaggtgtg-3'(seq id no:3)、探针s1-1：5'-cggtgggtactaggtgt-3'(seq id no:22)和

175、探针s1-2：5'-cggtgggtactaggtg-3'(seq id no:23)；

176、其中当所述探针s1是s1-1时，所述第一引物对选自：

177、1)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

178、2)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

179、3)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

180、4)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

181、以及

182、5)正向引物f1-3(seq id no:11)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

183、当所述探针s1是s1-2时，所述第一引物对选自：

184、1)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

185、2)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

186、3)正向引物f1-1(seq id no:1)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

187、4)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-1(seq id no:2)；

188、5)正向引物f1-2(seq id no:10)和反向引物r1-5(seq id no:12)；

189、以及

190、6)正向引物f1-3(seq id no:11)和反向引物r1-6(seq id no:13)；

191、ii.探针s3，其选自：

192、探针s3-0：5'-tcggttcccttgtggc-3'(seq id no:6)、探针s3-1：5'-atcggttcccttgtggc-3'(seq id no:24)和

193、探针s3-2：5'-cggttcccttgtggc-3'(seq id no:25)；

194、其中当所述探针s3是s3-1时，所述第二引物对选自：

195、1)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

196、2)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

197、3)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

198、4)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

199、以及

200、5)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

201、当所述探针s3是s3-2时，所述第二引物对选自：

202、1)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

203、2)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-1(seq id no:5)；

204、3)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-2(seq id no:15)；

205、4)正向引物f3-1(seq id no:4)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

206、5)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-4(seq id no:17)；

207、以及

208、6)正向引物f3-3(seq id no:14)和反向引物r3-3(seq id no:16)；

209、iii.探针s4，其选自：

210、探针s4-0：5'-acatgctacaatggccgg-3'(seq id no:9)和

211、探针s4-1：5'-acatgctacaatggccggt-3'(seq id no:26)；

212、其中当所述探针s4是s4-1时，所述第三引物对选自：

213、1)正向引物f4-1(seq id no:7)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

214、2)正向引物f4-3(seq id no:18)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

215、3)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-1(seq id no:8)；

216、4)正向引物f4-1(seq id no:7)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

217、5)正向引物f4-3(seq id no:18)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

218、6)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-3(seq id no:20)；

219、以及

220、7)正向引物f4-5(seq id no:19)和反向引物r4-6(seq id no:21)。

221、所述扩增步骤a)可以例如在单一反应混合物中用所述三个引物对和所述相关探针同时进行。

222、根据又另一个实施方案，本技术还涉及一种用于生产生物药物产品的方法，所述方法包括通过进行如上文公开的用于检测任何分枝杆菌的rrs基因的序列的本发明方法来检测分枝杆菌污染的步骤。所述测试分枝杆菌污染的步骤可以在生物药物产品制造期间的任何一个或多个阶段进行，例如对原材料(如对细胞基质和/或病毒种子和/或培养基和/或细胞培养物)进行，和/或对生物药物产品收获物和/或对配制的生物药物产品和/或对填充的生物药物产品进行。当根据如上文公开的本发明的方法检测到原材料或生物药物产品(即，来自原材料或生物药物产品的样品)被分枝杆菌污染时，将所述原材料或所述生物药物产品从所述生产方法中丢弃。通过根据如上文公开的本发明的方法进行测试，将确定为没有分枝杆菌污染的产品(如原材料或生物药物产品)(即，确定其样品没有分枝杆菌污染)维持在所述生产方法中。用于生产生物药物产品的这种方法可以进一步包括发布基于通过使用本发明的三个引物对和相关探针没有检测到任何扩增产物，已经通过所述测试的生物药物产品的步骤。

223、用于生产生物药物产品的所述方法可以是用于生产没有分枝杆菌污染的生物药物产品的方法，所述方法包括提供生物药物产品的步骤和对所述生物药物产品进行如上文公开的用于检测任何分枝杆菌的rrs基因的序列的本发明的方法的步骤。

224、所述生物药物产品可以是生物产品或药物产品；合适的产品是疫苗。

225、基于所述引物和所述探针的另外的用途和方法也是本发明的一部分。

226、定义：

227、分枝杆菌：根据本发明的分枝杆菌是根据通过新鉴定的物种补全的2018年2月的分类(gupta等人,2018)的分枝杆菌科的细菌。目前，在本发明的日期，此科包括来自以下先前定义的属的217个物种、亚种或变种：拟分枝杆菌属、分枝菌酸杆形菌属、分枝菌酸杆菌属、分枝菌酸小杆菌属和分枝杆菌属；这代表217个不同的序列。这些不同的物种和亚种或变种在表4中详述，它们对应于序列已经通过出版物验证的分枝杆菌；这些细菌在本发明中被视为分枝杆菌，不管它们在分枝杆菌科中的分类如何。

228、靶序列的分枝杆菌特异性扩增是指分枝杆菌的所有相关物种中(即，217个物种、亚种或变种中)的靶序列的扩增。

229、下文中的分枝杆菌物种是指这217个物种、亚种或变种中的任一个。