一种裂壶菌和红法夫酵母联合培养生产富含虾青素油脂的方法与流程

本发明属于微生物，具体涉及一种裂壶藻和红法夫酵母联合培养生产富含dha和虾青素油脂的方法。

背景技术：

1、二十二碳六烯酸(dha)是一种长链多不饱和脂肪酸(lc～pufa)，其在神经系统、心血管系统和大脑发育中具有许多有益功能而受到广泛关注。dha的传统来源主要是从深海鱼油当中提取而得，但该方法存在着鱼油成分复杂、易受污染、有鱼腥味等缺陷。因此人们不断探索dha的其它来源，其中产油微生物，如裂壶藻等，以其产量高、产油品质稳定等优势越来越受到人们的青睐。2014年，欧盟批准裂壶藻(schizochytrium sp.)油脂作为新型的食品配方。

2、裂壶藻是目前研究最多的用于生产dha的微藻之一，是生产omega-3的一个非常有前途的来源。然而，单独培养裂壶藻，所产油脂内虾青素含量较低，同时油脂的氧化程度较高，生产阶段的高成本和低产量使得培养过程的优化成为必然。目前，微藻细胞与酵母细胞共培养是提高dha和生物质产量的一种很有前景的策略。在联合培养过程中，两者在气体和物质交换以及ph值方面创造了一个平衡的环境，所产生的协同效应，有望促进裂壶藻产dha。

3、红法夫酵母(phaffia rhodozyma)因其具有快速合成代谢及高细胞密度繁殖的优势而成为与微藻共培养的候选酵母种之一。它在氧气和光照存在下具有非常高的生长速度并且还会产生有益的副产物，如虾青素。虾青素(c40h52o4)是一种脂溶性、深红色的类酮胡萝卜素，具有高抗氧化能力，其抗氧化活性是番茄红素、β～胡萝卜素、生育酚和抗坏血酸的十倍甚至百倍。因此将裂壶藻和红法夫酵母进行联合培养，使两种微生物在代谢过程中产生协同效应，进而使得裂壶藻所产生的油中蕴含虾青素，从而提高油脂中dha的抗氧化能力，有效避免dha在储存过程中氧化。

技术实现思路

1、为了解决本领域存在的技术问题，本发明的目的是提供一种联合培养生产富含dha和虾青素油脂的方法，以红法夫酵母菌和裂壶藻构建了一种菌藻共培养体系，在该体系中，葡萄糖和木糖的混合物作为碳源，促进了菌体dha和虾青素的积累。该方法能够大大提高裂壶藻藻油中虾青素含量，提高藻油产品的稳定性，并且缩短培养时间，降低生产成本。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提出一种裂壶菌和红法夫酵母联合发酵培养生产富含虾青素油脂的方法，包括以下步骤：

4、步骤1，裂壶藻、红法夫酵母分别接种到种子培养基中进行活化，得红法夫酵母种子液和裂壶藻种子液；

5、步骤2，红法夫酵母种子液和裂壶藻种子液分别接种至发酵培养基进行增殖发酵后，得红法夫酵母液与裂壶藻酵液；

6、步骤3，将红法夫酵母酵液接种至裂壶藻酵液，进行联合发酵培养；

7、步骤4，将联合发酵培养液进行油脂提取。

8、在一些本发明具体实施例中，用碱调节联合发酵液的ph为8.5～9.5，温度50～60℃，保温1.5～3h；加入0.5～1.0％发酵液体积的无水硫酸镁，控制温度78～80℃，搅拌1～2h，ph为8.5～9.5；加入0.2％～0.5％破壁液体积的一水合柠檬酸，ph为7.5～8.0(25℃)，混匀离心分层，取出上层油脂。

9、在一些本发明具体实施例中，用氢氧化钾溶液来调节联合发酵液的ph为8.5～9.5，温度50～60℃保温1.5～3h；保温完成后，加入0.5～1.0％发酵液体积的无水硫酸镁，控制温度78～80℃，搅拌1～2h，ph为8.5～9.5；加入0.2％～0.5％破壁液体积的一水合柠檬酸，ph为7.5～8.0(25℃)，混匀后停止搅拌，在5000rpm条件下离心10min后分层，取出上层油脂。

10、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3联合发酵培养的过程中额外添加木糖、葡萄糖或者以上两者的混合物。

11、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3，每1l红法夫酵母和裂壶藻混合酵液中，所述木糖的投料0～30g，优选20g。

12、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3，每1l红法夫酵母和裂壶藻混合酵液中，所述葡萄糖的投料0～30g，优选10g。

13、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3中，红法夫酵母酵液接种至培养36～60h后的裂壶藻酵液，优选接种至培养48h后的裂壶藻酵液。

14、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3中，所述红法夫酵母酵液接种至裂壶藻酵液的接种量为裂壶藻发酵液体积的30％～100％。

15、在一些本发明具体实施例中，所述联合发酵培养在光照下进行。

16、在一些本发明具体实施例中，步骤3中，光照强度8000～12000lux，优选10000lux。

17、在一些本发明具体实施例中，步骤3中，发酵过程持续光照培养72～120h，优选96h。

18、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3中，所述联合发酵培养的温度为20～30℃，优选25℃。

19、在一些本发明具体实施例中，所述步骤3中，所述联合发酵培养的摇床转速为180～220rpm，优选180rpm，

20、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1中红法夫酵母活化温度20～30℃，优选25℃。

21、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1中红法夫酵母活化过程中混匀采用摇床，所述摇床转速为160～200rpm，优选180rpm。

22、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1中红法夫酵母的活化时间为48～96h，优选72h。

23、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1中裂壶藻种子液的活化温度20～30℃。

24、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1裂壶藻活化过程中的转速为160～200rpm，优选180rpm。

25、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1裂壶藻活化时间为12～36h，优选24h。

26、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中红法夫酵母的接种量为3～10％，优选5％。

27、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中裂壶藻种子液的接种量为3～7％，优选5％。

28、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，裂壶藻酵液的培养条件为温度20～30℃，优选25℃。

29、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，裂壶藻酵液的增殖发酵的摇床转速为160～200rpm，优选180rpm。

30、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，裂壶藻酵液的时间36～60h，优选48h。

31、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，所述红法夫酵液的培养温度为20～30℃。

32、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，所述红法夫酵液的摇床速度为160～200rpm，优选180rpm。

33、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，所述红法夫酵液的的培养温度为20～25℃，优选22℃。

34、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1中，裂壶藻菌接种于种子培养基，该种子培养基包括，葡萄糖40～70g/l、酵母浸出粉8～12g/l、硫酸铵0.8～1.2g/l、无水硫酸钠13～17g/l、七水硫酸镁3.5～4.6g/l、磷酸二氢钾0.8～1.2g/l无水、氯化钙0.15～0.19g/l、碳酸钙1.5～2.5g/l，调节ph 5.5～6.0，溶剂为水。

35、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中裂壶藻种子液接种至发酵培养基，该发酵培养基包括，葡萄糖40～70g/l，酵母浸出粉8～12g/l，硫酸铵0.8～1.2g/l，无水硫酸钠13～17g/l，碳酸钙1.5～2.5g/l，氯化钠0.08～0.12g/l，无水氯化钙0.15～0.19g/l，氯化钾0.3～0.6g/l，七水硫酸镁3.7～4.4g/l，硫酸钾0.5～0.7g/l，磷酸二氢钾0.8～1.2g/l，硫酸铜0.03～0.06g/l，调节ph 5.5～6.0，溶剂为水。

36、在一些本发明具体实施例中，所述步骤1中，红法夫酵母菌接种至种子培养基，该种子培养基包括葡萄糖25～35g/l，酵母浸出粉3.8～4.9g/l，碳酸钙1.5～2.5g/l，氯化钠0.08～0.12g/l，氯化钾0.013～0.017g/l，磷酸二氢钾1.2～1.6g/l，无水氯化钙0.10～0.14g/l，硫酸铜0.03～0.07g/l，调节ph 5.5～6.0，溶剂为水。

37、在一些本发明具体实施例中，所述步骤2中，红法夫种子液接种至发酵培养基，该发酵培养基包括葡萄糖28～35g/l，酵母浸出粉3.8～4.8g/l，碳酸钙1.5～2.5g/l，氯化钠0.07～0.12g/l，无水氯化钙0.10～0.14g/l，氯化钾0.013～0.017g/l，硫酸镁2.0～2.9g/l，硫酸钾0.4～0.7g/l，磷酸二氢钾1.0～1.6g/l，硫酸铵0.8～1.2g/l，硫酸铜0.04～0.06g/l，调节ph5.5～6.5，溶剂为水。

38、加术语说明：

39、“pov”在本发明中指代过氧化值，是指油脂中过氧化物含量，反映油脂中的氧化程度。

40、有益效果

41、本发明至少包括以下有益效果：在裂壶藻生长稳定期，引入红法夫酵母，酵母的快速生长会导致有机酸和co2的产生，从而降低发酵培养基的ph。在低ph环境下，裂壶藻的生长会逐渐转向脂质的积累，进而提高油脂的产量；在联合培养过程中，额外添加葡萄糖和木糖作为碳源，红法夫酵母以木糖为碳源进行生长代谢，其代谢产物可为裂壶藻的共培养提供更多营养物质；所产的dha油中蕴含虾青素，可提高油脂中dha的抗氧化能力，有效避免dha在储存过程中氧化。