一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法与流程

本发明涉及鱼类遗传选育，尤其涉及一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法。

背景技术：

1、大口黑鲈(micropterus salmoides)，俗称加州鲈，为硬骨鱼纲(osteichthyes)、辐鳍鱼亚纲(actinopterygii)鲈形目(perciformes)、太阳鱼科(cehtrachidae)黑鲈属(micropterus)，是一种优质的淡水鱼类。随着大口黑鲈养殖规模的扩大，其病害问题也越来越突出。大口黑鲈蛙虹彩病毒(largemouth bass ranavirus,lmbv)感染大口黑鲈引起的蛙虹彩病毒病可以导致大面积鱼爆发疾病死亡，引起鱼灾。

2、对大口黑鲈苗种检疫和感染初期的防控是控制蛙虹彩病毒病暴发的主要措施，解剖后可见鱼鳔膨大，布满红色气腺，有时鱼鳔中有黄色或褐色蜡样分泌物。目前已研发出抗lmbv的中药和疫苗，但难以从根本上防治lmbv感染。目前对大口黑鲈的分子生物学防控lmbv方法，主要停留在检测诊断是否感染lmbv。

3、杜宏瑶对大口黑鲈trim23在病毒宿主互作中功能的初步探究，通过感染溃疡综合征病毒(largemouth bass ulcerative syndrome virus,lbusv)的大口黑鲈分析出差异基因trim23，表明trim 23通过负调节ifn应答来影响病毒复制(杜宏瑶.大口黑鲈trim23在病毒宿主互作中功能的初步探究[d].安徽农业大学,2023.doi:10.26919/d.cnki.gannu.2023.000465.)。中国专利cn117947179a公开了一种大口黑鲈抗snprv(弹状病毒)的分子标记及筛选方法，筛选获得的大口黑鲈抗感染性能相关的分子标记，并将其用于抗弹状病毒的亲本的筛选。因此，迫切需要加强对大口黑鲈抗lmbv的分子生物学研究，特别是相关抗性分子标记，以获得抗性大口黑鲈品种，从根本上防治lmbv感染。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法，检测待测大口黑鲈基因组的snp位点，所述snp位点位于大口黑鲈基因组3号染色体上的第38930790位核苷酸，基因型为cc的样本对蛙虹彩病毒的抗性显著高于gg和gc基因型的样本；所述大口黑鲈基因组的genbank登录号为：asm1485139v1。

4、本发明通过检测所述snp位点的基因型，即可得到大口黑鲈抗病毒的性状，提供了一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法。

5、进一步地，所述病毒为蛙虹彩病毒。

6、进一步地，所述方法包括以下步骤：

7、s1：提取被鉴定的样本的基因组dna；

8、s2：检测步骤s1基因组dna的snp位点的基因型；

9、s3：根据步骤s2所述的基因型，判定被鉴定的样本的抗病毒性状。

10、进一步地，以步骤s1的基因组dna为模板，根据所述snp位点位置信息设计引物，进行pcr反应，得到pcr扩增产物，分析所述snp位点的基因型。

11、在本发明具体实施方式中，所述引物的核苷酸序列如seq id no：1～3所示。

12、第二方面，本发明提供了一种抗病毒大口黑鲈育种方法，用所述方法检测大口黑鲈的snp位点的基因型，基因型为cc的大口黑鲈，作为亲本，对所述亲本进行繁育，得到抗病毒的大口黑鲈品种。

13、第三方面，本发明提供了一种检测大口黑鲈基因组中snp位点的pcr试剂，所述pcr试剂中包括核苷酸序列如seq id no：1～3所示的引物。

14、第四方面，本发明提供了所述pcr试剂在鉴别大口黑鲈抗病毒相关的性状、制备鉴别大口黑鲈抗病毒性状的试剂盒和/或抗病毒大口黑鲈育种中的应用中的应用。

15、第五方面，本发明提供了一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的试剂盒，所述试剂盒中含有所述pcr试剂。

16、在本发明具体实施方式中，所述试剂盒还含有flu-arms 2×pcr mix和水。

17、以待测大口黑鲈基因组dna为dna模板，以核苷酸序列为seq id no：1～3所示的引物，进行pcr扩增，得到扩增产物，检测扩增产物第25bp处的碱基，确定待测大口黑鲈snp位点的基因型，判断待测大口黑鲈抗蛙虹彩病毒性状。

18、pcr扩增程序为：95℃10min；95℃15s，61～55℃梯度退火60s(-0.6℃/循环，每个循环降低0.6℃)，10个循环；95℃15s，55℃60s，共30个循环；30℃30s。

19、pcr扩增体系(总体积10μl)为：dna模板5ng～250ng(优选5ng～50ng)，flu-arms 2×pcr mix 5μl，上游分型引物f1(10μm)0.05μl～0.25μl(优选0.1μl)、下游分型引物f2(10μm)0.05μl～0.25μl(0.1μl)，下游通用引物r(10μm)0.1μl～0.5μl(优选0.3μl)，补水至10μl。

20、核苷酸序列如seq id no：1～3所示的引物的扩增产物的核苷酸序列如seq idno：4所示。snp位点位于扩增产物的5’端的第25bp(即genbank登录号：asm1485139v1的参考大口黑鲈基因组3号染色体的g 38930790处)时，cc基因型的大口黑鲈样本对蛙虹彩病毒的抗性显著高于gg和gc基因型，感染蛙虹彩病毒后存活时间长。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

22、本发明公开了一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法，且设计了检测大口黑鲈基因组中snp位点的试剂，所述试剂包括核苷酸序列如seq id no：1～3所示的引物，用于检测大口黑鲈的snp位点g 38930790的基因型。经关联分析，该位点的不同基因型与对蛙虹彩病毒抗性显著相关，其中cc基因型的大口黑鲈样本对蛙虹彩病毒的抗性显著高于gg和gc基因型，感染蛙虹彩病毒后存活时间长。本发明确定了在大口黑鲈免疫抗病方面的snp位点，为开展大口黑鲈抗蛙虹彩病毒分子育种提供了相关有效分子标记，并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。

技术特征：

1.一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法，其特征在于，检测待测大口黑鲈基因组的snp位点，所述snp位点位于大口黑鲈基因组3号染色体上的第38930790位核苷酸，基因型为cc的样本对蛙虹彩病毒的抗性显著高于gg和gc基因型的样本；所述大口黑鲈基因组的genbank登录号为：asm1485139v1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为蛙虹彩病毒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以步骤s1的基因组dna为模板，根据所述snp位点位置信息设计引物，进行pcr反应，得到pcr扩增产物，分析所述snp位点的基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no：1～3所示。

6.一种抗病毒大口黑鲈育种方法，其特征在于，用权利要求1～5任一项所述方法检测大口黑鲈的snp位点的基因型，基因型为cc的大口黑鲈，作为亲本，对所述亲本进行繁育，得到抗病毒的大口黑鲈品种。

7.一种检测大口黑鲈基因组中snp位点的pcr试剂，其特征在于，所述pcr试剂中包括核苷酸序列如seq id no：1～3所示的引物。

8.权利要求7所述pcr试剂在鉴别大口黑鲈抗病毒相关的性状、制备鉴别大口黑鲈抗病毒性状的试剂盒和/或抗病毒大口黑鲈育种中的应用。

9.一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求7所述pcr试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有flu-arms2×pcrmix和水。

技术总结本发明涉及一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法，属于鱼类遗传选育技术领域。本发明提供了一种鉴定大口黑鲈抗病毒性状的方法，检测待测大口黑鲈基因组的SNP位点，所述SNP位点位于大口黑鲈基因组3号染色体上的第38930790位核苷酸，基因型为CC的样本对蛙虹彩病毒的抗性显著高于GG和GC基因型的样本；所述大口黑鲈基因组的GenBank登录号为：ASM1485139v1。本发明确定了在大口黑鲈免疫抗病方面的SNP位点，为开展大口黑鲈抗蛙虹彩病毒分子育种提供了相关有效分子标记，并为解析其抗病性状的遗传机制提供理论基础。技术研发人员：李宁求,黎品红,罗霞,李文贤,林强,梁红茹,付小哲,牛银杰,马宝福受保护的技术使用者：中国水产科学研究院珠江水产研究所技术研发日：技术公布日：2024/11/14