一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法及细胞培养方法

本发明涉及生物医学工程，尤其涉及一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法及细胞培养方法。

背景技术：

1、干细胞疗法为一些临床难以治疗的疾病，如糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等，提供了一条全新的治疗途径。鉴于干细胞在治疗中的巨大潜能，人们对其培养、传代、扩增工艺进行了大量、深入的研究。

2、传统的二维细胞培养方式虽然操作简便，但存在一些明显的缺点，例如生长面积小、细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用受限，无法模拟体内的三维微环境等。此外，传统用于分离贴壁干细胞的传统酶消化法也存在一些局限性，例如酶消化对会影响细胞的活性和功能，多次传代后可能会影响细胞活力，改变干细胞的表型和功能，而且高浓度高活性的胰酶还可能对细胞产生毒性作用，甚至导致细胞死亡。虽然近年来也开发出一些例如磁珠分离法、流式细胞术等无酶消化方法，以避免酶消化对细胞的影响，但也存在过程繁琐，成本高等缺点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法及细胞培养方法，解决传统的二维细胞培养干细胞的方式虽然操作简便，但存在生长面积小、细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用受限，无法模拟体内的三维微环境以及多次酶消化影响细胞活性及功能的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法及细胞培养方法，所述用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法，步骤如下：

3、步骤一、将来源于家蚕蚕丝的丝素蛋白采用甲基丙烯酸缩水甘油酯进行改性，得到改性后的丝素蛋白；

4、步骤二、利用所述改性丝素蛋白制备预聚物溶液，并对所述预聚物溶液进行预处理，得到处理聚物溶液；

5、步骤三、向所述处理聚物溶液内添加四甲基乙二胺和过硫酸铵反应剂，得到混合溶液，并将所述混合溶液加入模具内制冷，得到凝胶胚料；

6、步骤四、将所述凝胶胚料进行解冻，解冻后将所述凝胶胚料放入甲醇溶液浸泡，取出所述凝胶胚料采用去离子水进行清洗，得到待灭菌冻凝胶；

7、步骤五、将所述待灭菌凝胶置于高温高压灭菌锅中进行灭菌处理，得到灭菌后的丝素蛋白冻凝胶。

8、其中，步骤一的具体步骤如下：

9、将脱胶蚕丝溶解于溴化锂溶液中，放在恒温箱至澄清透明后取出；

10、滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液，并在水浴加热的同时进行搅拌反应；

11、将搅拌反应完成后的溶液进行过滤，倒入透析袋中透析，得到改性后的丝素蛋白；

12、将改性后的丝素蛋白冷冻干燥后得到改性后的丝素蛋白海绵。

13、其中，步骤二的具体步骤如下：

14、利用所述改性丝素蛋白制备预聚物溶液；

15、将所述预聚物溶液进行水浴加热处理，得到加热溶液；

16、将所述加热溶液置于冰水混合物内冷却，得到处理聚物溶液。

17、其中，步骤四的具体步骤如下：

18、用去离子水解冻所述凝胶胚料，将解冻后的所述凝胶胚料置于甲醇溶液中；

19、从甲醇溶液中取出所述凝胶胚料，用去离子水反复清洗，得到待灭菌凝胶。

20、其中，在步骤五中：所述高温高压灭菌锅的灭菌参数为压力为0.11mpa，温度为121℃，灭菌时间为20分钟。

21、本发明还提供一种细胞培养方法，采用如上述所述的用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法制备的冻凝胶，步骤如下：

22、将小鼠骨髓间充质干细胞植入上述灭菌后的丝素蛋白冻凝胶中进行三维培养；

23、将装载有小鼠骨髓间充质干细胞的丝素蛋白冻凝胶采用注射器进行无酶收获，并将收获后的细胞进行培养。

24、本发明的一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法及细胞培养方法，采用甲基丙烯酸缩水甘油酯对丝素蛋白进行改性，并利用氧化还原引发体系(aps/temed)使其发生冷冻聚合，随后在已有的化学交联网络中采用甲醇诱导丝素蛋白发生构象转变，制备出具有“化学-物理”双交联孔壁的丝素蛋白多孔冻凝胶。制备得到的冻凝胶具有微米级的贯通多孔结构，保证了营养物质和代谢产物的自由扩散，还有利于细胞的黏附、生长和迁移，能很好地支持干细胞的三维培养。而且制备得到的丝素蛋白冻凝胶具有优良的形状记忆功能和生物相容性，性能稳定，可通过高温高压灭菌以便于细胞培养。其次，来源于家蚕的丝素蛋白表面的rgd序列和其他生物活性肽序列较少，细胞粘附主要通过非特异性相互作用(静电相互作用和疏水作用)以及蛋白吸附介导，整体表现为中等细胞粘附水平，虽然相对于明胶或纤维连接蛋白涂层等生物材料的细胞粘附性较弱，但仍相比于合成高分子材料，展现出良好的细胞相容性和一定程度的粘附性。正因为家蚕丝素蛋白的这种中等细胞粘附水平，使得可以通过注射器的挤压，造成冻凝胶的暂时形变，通过施加剪切力促进细胞与孔道内壁间的粘附相互作用破坏，从而使细胞顺利地从冻凝胶的壁面剥离并进入流动的培养基介质中，实现三维培养的干细胞的快速无酶温和收获，而且使用后的冻凝胶材料还能循环使用，从而节约了使用成本。

技术特征：

1.一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法，其特征在于，步骤如下：

2.如权利要求1所述的用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法，其特征在于，步骤一的具体步骤如下：

3.如权利要求2所述的用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法，其特征在于，步骤二的具体步骤如下：

4.如权利要求3所述的用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法，其特征在于，步骤四的具体步骤如下：

5.如权利要求4所述的用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法，其特征在于，在步骤五中：

6.一种细胞培养方法，采用如权利要求5所述的用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法制备的冻凝胶，其特征在于，步骤如下：

技术总结本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于细胞三维培养和无酶收获的冻凝胶制备方法及细胞培养方法：首先制备改性丝素蛋白；然后利用改性丝素蛋白制备预聚物溶液，预处理后，得到处理预聚物溶液；之后向处理聚物溶液内添加四甲基乙二胺和过硫酸铵反应剂并制冷，得到凝胶胚料；随后将凝胶胚料解冻，解冻后放入甲醇溶液浸泡，取出凝胶胚料冲洗，得到待灭菌的冻凝胶；对冻凝胶进行灭菌处理，将干细胞种植在此冻凝胶内部，不仅可以实现细胞的三维培养，而且可以通过机械力挤压实现细胞的无酶收获，以此方式解决了传统的二维细胞培养干细胞的方式存在生长面积小、无法模拟体内的三维微环境以及多次酶消化影响细胞活性及功能的问题。技术研发人员：肖文谦,姚婧芝,李海艳,关浩卿,李林轩,周航,李波受保护的技术使用者：重庆科技大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14