一种细胞色素P450BM3突变体及其在区域选择性高效降解4-氯苯酚中的应用

本发明涉及环境修复微生物，特别涉及一种细胞色素p450bm3突变体及其在区域选择性高效降解4-氯苯酚中的应用。

背景技术：

1、4-氯苯酚(4-chlorophenol)是一种持久性环境污染物，在纸浆、木材防腐、阻燃剂、制药和炼焦炼钢等过程中随工业废水大量排放。4-氯苯酚不易自然降解，具有致癌、致突变和细胞毒性特性，已被世界卫生组织列为对人类的优先污染物和潜在致癌物质。吸附、浮选、高级氧化等物理化学方法已被用于4-氯苯酚的处理，但存在能耗高、易形成毒性更强的中间产物等问题。在当前节能减排、绿色低碳的技术要求下，以微生物新陈代谢为基础的生物处理技术优势更加明显。然而，由于污水处理系统中的微生物表达的降解酶对4-氯苯酚的识别能力弱、降解能力有限，且不具备区域选择性，导致部分代谢产物不能被下游酶识别，现有的污水生物处理系统对4-氯苯酚的处理效率低，含有4-氯苯酚的出水被排放至环境中，危害人体健康和生态安全。因此，开发对4-氯苯酚具有高区域选择性和高降解效率的降解酶，强化4-氯苯酚类持久性污染物的生物降解，具有广阔的应用前景和实际价值。

2、当前，通过对污染场地样本中的微生物进行分离和纯化，获得了对4-氯苯酚具有降解作用的菌株，如假单胞菌、白链霉菌、红球菌、氯酚节杆菌等。中国专利cn 111378601a公开的一种卤代苯酚降解菌株bosea sp.dcp-2，从农药化工厂厂区的土壤中分离筛选获得，可应用于降解2,4-二氯苯酚(2,4-dcp)、邻氯苯酚、对氯苯酚或间氯苯酚，5天后菌株dcp-2对2,4-dcp的降解率达到95.6％，但降解周期长，且对氯苯酚不是其优选降解底物。对4-氯苯酚的微生物降解途径进行解析发现4-氯苯酚的细菌降解通过氯邻苯二酚途径或对苯二酚途径进行。在氯邻苯二酚途径中，4-氯苯酚首先被单加氧酶转化为4-氯邻苯二酚，然后通过邻环裂解或间环裂解途径进行，第一步反应的单加氧酶在4-氯苯酚的降解过程中发挥着关键作用，其催化效率制约了微生物对4-氯苯酚的降解效率，同时，单加氧酶的区域选择性决定了第一步代谢产物能否被下游酶识别，从而实现4-氯苯酚的完全降解和矿化。中国专利cn 107619832 a公开了一种氯代硝基苯酚类化合物氧化还原酶基因簇cnpab及其应用，主要由2,6-二氯-4-硝基苯酚单加氧酶基因cnpa和还原酶基因cnpb构成。利用该基因簇构建的工程菌株表达的cnpa和cnpb能在30min内将0.1mm的2,6-二氯-4-硝基苯酚完全降解，但适宜降解的底物浓度较低，仅为0.1mm，对于高浓度的氯酚废水处理能力有限。单加氧酶细胞色素p450 bm3在降解外源环境污染物和生物自身代谢解毒中起着重要作用，可作为4-氯苯酚降解的第一步氧化酶。但天然来源的p450 bm3对4-氯苯酚的识别能力不足，降解效率低。因此，亟待开发一种对4-氯苯酚具有高降解效率和高区域选择性的p450 bm3突变体。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的提供一种提高关键降解酶的降解效率和区域选择性，提高对4-氯苯酚的高降解效率和选择性的细胞色素p450bm3突变体；本发明的第二目的为提供所述细胞色素p450bm3突变体在区域选择性高效降解4-氯苯酚中的应用。

2、技术方案：本发明所述的细胞色素p450bm3突变体，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列第51位、第82位、第330位至少有一个氨基酸进行置换；第51位酪氨酸tyr突变为缬氨酸val；第82位丙氨酸ala突变为甲硫氨酸met，第330位丙氨酸ala突变为苯丙氨酸phe。

3、细胞色素p450 bm3(pdb id：1fag)源自bacillus megaterium，氨基酸序列为seqid no.1所示，核苷酸序列为seq id no.2所示。

4、优选的，所述突变体包括y51v、a82m、a330f、y51v+a82m、y51v+a330f、a82m+a330f或y51v+a82m+a330f。

5、所述突变体y51v，即第51位酪氨酸tyr突变为缬氨酸val。

6、所述突变体a82m，即第82位丙氨酸ala突变为甲硫氨酸met。

7、所述突变体a330f，即第330位丙氨酸ala突变为苯丙氨酸phe。

8、所述突变体包括y51v+a82m，即第51位酪氨酸tyr突变为缬氨酸val，且即第82位丙氨酸ala突变为甲硫氨酸met。

9、所述突变体包括y51v+a330f，即第51位酪氨酸tyr突变为缬氨酸val，且即第330位丙氨酸ala突变为苯丙氨酸phe。

10、所述突变体包括a82m+a330f，即第82位丙氨酸ala突变为甲硫氨酸met，且即第330位丙氨酸ala突变为苯丙氨酸phe。

11、所述突变体包括y51v+a82m+a330f，即第51位酪氨酸tyr突变为缬氨酸val，第82位丙氨酸ala突变为甲硫氨酸met，且第330位丙氨酸ala突变为苯丙氨酸phe。

12、本发明所述的基因为：编码所述细胞色素p450bm3突变体蛋白的基因。

13、本发明所述的重组质粒为：含有所述基因的重组质粒。

14、优选的，所述重组质粒的表达载体为pet系列表达载体。

15、本发明所述的重组菌为携带所述突变体的基因或所述重组质粒的重组菌。

16、优选的，所述宿主为大肠杆菌c43(de3)或bl21(de3)。

17、所述的细胞色素p450bm3突变体或所述重组质粒或所述的重组菌在区域选择性高效降解4-氯苯酚生成4-氯邻苯二酚中的应用。

18、所述应用包括如下步骤：以细胞色素p450bm3突变体为催化剂，4-氯苯酚为底物，催化4-氯苯酚生成4-氯对苯二酚。催化机理如下：

19、

20、优选的，所述的催化的反应条件为：ph 6～8，温度20～45℃。

21、具体的应用方法为：向含p450 bm3突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后超声破碎获得的粗酶液中投加污染物4-氯苯酚，以ph6-8的缓冲液(优选7.5的kpi缓冲液)构成反应体系，在300-500rpm(优选为400rpm)，20-45℃(优选为25℃)条件下进行反应，反应结束后，获得含4-氯苯酚和4-氯邻苯二酚的反应液，向反应液中加入等体积的甲醇沉淀蛋白，12000rpm离心1min，取离心后的上清液使用0.22μm滤膜过滤获得待测样品，使用液相色谱检测样品中各物质含量。

22、优选的，所述kpi缓冲液体系是200mm磷酸钾缓冲溶液，由磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物组成，配置kpi溶液ph至7.5。

23、优选的，所述湿菌体按如下方法制备：将含有细胞色素p450 bm3突变体编码基因的重组工程菌接种到含有终浓度为30μg/ml卡那霉素的lb培养液中，在37℃条件下培养8h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度0.5％-5％(优选1％)的接种量接种至无菌的含有终浓度30μg/ml卡那霉素的tb液体培养基中，在37℃条件下培养约16-24h，使得菌体浓度od600为0.4-0.8，再向培养液中加入终浓度为30-50μm(优选40μm)的异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)和0.2-0.4mm(优选0.3mm)的δ-氨基乙酰丙酸(δ-ala)，20℃诱导表达24-48h后，4℃、4000rpm离心15-30min，收集湿菌体；lb液体培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。tb液体培养基：2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，72mm k2hpo4，17mm kh2po4，0.4％甘油。

24、本发明所述的p450 bm3突变体通过细胞破碎的粗酶液或者分离纯化的酶进行催化。此外，还可以利用特定的固定化技术将p450 bm3突变体制备成固定化酶或者固定化细胞形式的酶。

25、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)使用定向进化的手段对细胞色素p450 bm3进行改造，提高了酶对4-氯苯酚的区域选择和降解活性；(2)突变体y51v+a82m+a330f，其km和kcat分别为0.1mm和0.003s-1；(3)突变体y51v+a82m+a330f能够在水相常温条件下降解污染物4-氯苯酚，4h对2mm 4-氯苯酚降解率达56％，是野生型p450bm3降解效率的6.5倍，产生单一降解产物4-氯邻苯二酚(区域选择性＞99％)，适用ph范围为6～8，具有高效率、低能耗、高区域选择性的特点，从而更有利于实现工业化应用。