一种治疗2型糖尿病的sPL温敏凝胶的制备方法及使用方法与流程

本发明涉及2型糖尿病治疗药物领域，尤其涉及一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法及使用方法。

背景技术：

1、糖尿病是一种多因素引发的慢性疾病，影响着全球很大一部分人口健康。在过去的40年里，全世界患有糖尿病的成人人数巨大，且其中90-95％为2型糖尿病(type2diabetes mellitus,t2dm)。t2dm是一种以胰岛素抵抗和血糖水平升高为特征的代谢性慢性疾病。与1型糖尿病不同，2型糖尿病相对异质且非常复杂，涉及许多影响胰腺及其他代谢器官功能(β细胞、脂肪组织、肝脏和肌肉等)的病理生理机制，该病的治疗非常具有挑战性。目前，存在大量药物及药物组合能够控制血糖水平，如脂联素、glp-1肽受体激动剂等，但这些药物均无法使病情逆转，并控制发症的发生。

2、现有利用血小板裂解液治疗糖尿病的方法中，血小板裂解液中的炎症控制及免疫调节类因子数量低，种类少，作用不持久。

技术实现思路

1、本发明是要解决现有血小板裂解液存在炎症控制及免疫调节类因子数量低，种类少，作用不持久的问题，提供一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法及使用方法。

2、本发明治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，包括以下步骤：

3、一、向血液中加入葛根素，于4℃中保存24～36h；然后将血液离心收集富血小板血浆(prp)；将富血小板血浆裂解，制备血小板裂解液apl；

4、二、骨髓间充质干细胞培养至完全融合后，将培养基更换为诱导液，继续诱导培养96～98h；

5、所述诱导液为含5μg/ml～5mg/ml胰岛素、0.5～5μm地塞米松和0.1～1ng/ml桦褐孔菌黄酮的dmem/f12基础培养基；

6、三、将诱导后的骨髓间充质干细胞提取细胞外囊泡，用pbs重悬，获得囊泡悬浮液；

7、四、将步骤三得到的囊泡悬浮液进行超声裂解，得到囊泡裂解液，然后将步骤一的血小板裂解液与囊泡裂解液进行混合，得到spl混合液；

8、五、制备壳聚糖-泊洛沙姆凝胶，将spl混合液与壳聚糖-泊洛沙姆凝胶混合，制备得到spl温敏凝胶。

9、进一步的，步骤一血液中葛根素的浓度为0.05～0.2μm。

10、进一步的，步骤一中血小板裂解液apl的制备方法为：

11、向富血小板血浆中分别添加cacl2和iii型胶原，置于-80℃冻存8～9h后，于37℃解冻5～10min，然后反复冻融10次，反复冻融1次的过程为：-80℃冷冻1h再于37℃解冻5～10min；将最后一次解冻后的裂解液于离心，取上清，得到充分激活的血小板裂解液apl。其中prp中cacl2的浓度为25mmol/l，prp中iii型胶原的浓度为20μg/ml。

12、进一步的，步骤二中桦褐孔菌黄酮的制备方法：

13、将桦褐孔菌(购买自特医食品研发中心有限公司)研磨成粉后，利用70％的乙醇在75℃下加热回流提取1h，收集上清液；重复加热回流提取3次后，合并上清液，然后于70℃下加热浓缩，即得到桦褐孔菌黄酮。

14、进一步的，步骤三中提取细胞外囊泡的方法为：

15、将诱导后的骨髓间充质干细胞清洗，用dmem/f12基础培养基培养12～14h后，收集培养液，将培养液离心，取上清液，于4℃以10000×g的速度离心去除细胞碎片；然后将上清液转移至超速离心管中，于4℃以100000×g超速离心75～80min，保留管底沉淀，即为细胞外囊泡。

16、进一步的，步骤四中血小板裂解液与囊泡悬浮液按照体积比1:(1～2)混合。

17、进一步的，步骤五中spl混合液与壳聚糖-泊洛沙姆凝胶的体积比为1:(5～9)。

18、本发明spl温敏凝胶的使用方法为：将spl温敏凝胶注射至小鼠胰背动脉外围。

19、进一步的，所述注射计量为0.2ml/只。

20、本方法制备的spl温敏凝胶可以在胰背动脉外围凝固贴附，并使其中因子缓慢释放，持久的释放到胰背动脉中，进而调节胰腺及周围组织的功能，改善胰岛素抵抗状态，提高2型糖尿病治疗效果。

21、本发明的有益效果：

22、1、本发明利用cacl2和iii型胶原进行prp中血小板α颗粒激活释放其中因子，结合反复冻融方法使血小板充分裂解，获得充分激活的血小板裂解液，另外，在prp制备前，血液中加入葛根素刺激24h，可促使白细胞分泌更多抗炎因子及抗氧化因子，最终制备的apl中抗炎、抗氧化因子种类和数量丰富。

23、2、本发明向培养的bmscs中加入5μg/ml～5mg/ml胰岛素、1～5μm地塞米松，刺激96h，可诱导bmscs分泌炎性调节因子及免疫调节因子。另加入0.1～1ng/ml桦褐孔菌黄酮刺激，可增加抗炎因子及免疫调节因子分泌量，抑制促炎因子分泌。

24、3、将apl和诱导后的bmscs囊泡裂解液混合，组合制备多细胞因子团spl。所获得的因子种类更多，作用更强，可以更好的实现疾病治疗的目的。

25、4、本发明主要是制备了一种用于2型糖尿病治疗的spl温敏凝胶。凝胶中主要成分为泊洛沙姆、壳聚糖及spl。泊洛沙姆具有良好的可逆胶凝特性、生物相容性、低毒性，它在低温下可以自由流动，在体温下转变成凝胶，胶凝后再遇到低温时又转变为液态，此体系不仅能满足spl低温存储的需求，也可以方便注入体内，根据疾病类型局部给药，提高局部药物浓度，避免产生全身性的作用。泊洛沙姆和壳聚糖组合进行凝胶制备，可使spl更好的包裹于所形成的凝胶孔径中，实现spl因子的缓释作用，延长药物停留时间，提高生物利用度。

技术特征：

1.一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一血液中葛根素的浓度为0.05～0.2μm。

3.根据权利要求1或2所述的一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一中血小板裂解液apl的制备方法为：

4.根据权利要求3所述的一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中提取细胞外囊泡的方法为：

5.根据权利要求1所述的一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤四中血小板裂解液与囊泡悬浮液按照体积比1:(1～2)混合。

6.根据权利要求5所述的一种治疗2型糖尿病的spl温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤五中spl混合液与壳聚糖-泊洛沙姆凝胶的体积比为1:(5～9)。

7.如权利要求1所述方法制备的spl温敏凝胶的使用方法，其特征在于，该方法为：将spl温敏凝胶注射至小鼠胰背动脉外围。

8.根据权利要求7所述的spl温敏凝胶的使用方法，其特征在于，所述注射计量为0.2ml/只。

技术总结一种治疗2型糖尿病的sPL温敏凝胶的制备方法及使用方法，涉及2型糖尿病治疗药物领域，是要解决现有血小板裂解液存在炎症控制及免疫调节类因子数量低，种类少，作用不持久的问题。方法：一、向血液中加入葛根素，制备血小板裂解液aPL；二、骨髓间充质干细胞培养至完全融合后，将培养基更换为诱导液培养；三、将诱导后的骨髓间充质干细胞提取细胞外囊泡，获得囊泡悬浮液；四、将血小板裂解液与囊泡悬浮液进行混合，得到sPL混合液；五、制备壳聚糖‑泊洛沙姆凝胶，将sPL混合液与壳聚糖‑泊洛沙姆凝胶混合，制备得到sPL温敏凝胶。本方法能够促进抗炎、抗氧化因子分泌，提高2型糖尿病治疗效果。本发明用于治疗2型糖尿病。技术研发人员：刘春香,张怡,张天琦,孟令旗,刘艳青受保护的技术使用者：天晴干细胞股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18