一种提高NK细胞杀伤活性的方法与流程

本发明涉及nk细胞培养，尤其涉及一种提高nk细胞杀伤活性的方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(nk细胞)，是与t细胞和b细胞并列的一类淋巴细胞，其是组成天然免疫系统中的主要元素。nk细胞除了会参与先天性免疫应答之外，其还在适应性免疫调节中起着重要的调控作用。相关的研究发现，nk细胞可以在病原微生物感染，自身免疫病和肿瘤等多种病理过程中发挥主要作用。

2、nk细胞主要通过其表面受体与mhc i类分子结合，直接识别靶细胞，其不需要抗原提呈细胞的参与。当nk细胞被激活的时候，其一方面可以通过细胞毒作用杀伤靶细胞，另一方面其可以分泌细胞因子如白细胞介素2，γ-干扰素等激活其他效应淋巴细胞。

3、在外周血淋巴细胞中nk细胞含量只有10％左右，nk细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增nk细胞，但上述方法扩增的nk细胞与临床需求仍存在一定的差距。而且，对于nk细胞的进一步使用，nk细胞的杀伤活性依然有待提高，因此，寻找提高nk细胞杀伤活性的方法将有助于更好的发挥nk细胞的作用，并应用在自身免疫病、肿瘤等疾病的治疗当中。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提高nk细胞杀伤活性的方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种提高nk细胞杀伤活性的方法，包括如下步骤：

4、(1)将外周血进行分离，得到pbmc细胞；

5、(2)将所述pbmc细胞进行分离，得到nk细胞；

6、(3)将nk细胞接种于nk细胞培养基进行培养；

7、所述nk细胞培养基包括：1～2g/l l-赖氨酸、0.2～0.6g/l甲硫氨酸、1～2g/ll-色氨酸、1～2g/l l-脯氨酸、6～10g/l谷胱甘肽、5～9g/l辅酶1、1～2g/l丝肽粉、60～70ml/l人血浆、8～12g/l人血清白蛋白、0.16～0.18μl/ml白细胞介素-10、0.2～0.4μl/ml白细胞介素-13、0.3～0.5μl/ml白细胞介素-18，其余为基础培养基。

8、优选的，所述基础培养基为lonzax-vivo 15无血清培养基、scgm无血清培养基或takarank细胞无血清培养基。

9、优选的，所述培养的温度为37～38℃，co2的体积浓度为5％～6％。

10、优选的，所述培养的时间为13～15天。

11、优选的，所述接种的细胞密度为7～9×105个/ml。

12、优选的，所述培养的过程中，在培养第0～7d，每2～3天补加前期补液培养基，以后每2～3天补加后期补液培养基；补液后始终保持细胞密度为7～9×105个/ml。

13、优选的，所述前期补液培养基包括：60～70ml/l人血浆、0.16～0.18μl/ml白细胞介素-10、0.2～0.4μl/ml白细胞介素-13和0.3～0.5μl/ml白细胞介素-18，其余为基础培养基。

14、优选的，所述后期补液培养基包括：0.2～0.3μl/ml白细胞介素-10、0.5～0.6μl/ml白细胞介素-13和0.6～0.7μl/ml白细胞介素-18，其余为基础培养基。

15、本发明还提供了所述的提高nk细胞杀伤活性的方法制备得到的nk细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

16、优选的，所述肿瘤为非小细胞肺癌、慢性髓性白血病、结直肠癌或乳腺癌。

17、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

18、利用含有白细胞介素的培养基培养nk细胞能够获得杀伤活性显著提高的nk细胞，本发明将三种白细胞介素：白细胞介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-18配合使用，nk细胞杀伤活性明显提高，而如果替换成其他种类的白细胞介素，其效果远不如本发明。

19、本发明所使用氨基酸的均为非极性氨基酸，该种类的氨基酸能有效缩短nk细胞生长的迟滞期，从而能尽快的扩增和传代。培养基中所添加的丝肽粉具有保护作用，可以缓和外界刺激对于支原体生长的影响。谷胱甘肽可保护细胞免受氧化应激影响，并有助于细胞内外形成有利的氧化还原环境，也有助于缩短nk细胞生长的迟滞期。

20、本发明所提供的培养基还添加了nk细胞生长激活剂，包括辅酶1，上述组分的添加对nk细胞的生长起到了激活作用，促进了nk细胞的扩增。这是因为辅酶1促进了某些关键代谢途径的顺利进行，为细胞的生长和分裂提供了必要的能量和中间产物，从而有利于细胞数量的增加，起到了生长激活作用。

21、本发明方法在保证nk细胞高活率的同时，又能够使nk细胞快速大量扩增，可获得高纯度、高杀伤活性的nk细胞。

技术特征：

1.一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述基础培养基为lonzax-vivo 15无血清培养基、scgm无血清培养基或takarank细胞无血清培养基。

3.根据权利要求1所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述培养的温度为37～38℃，co2的体积浓度为5％～6％。

4.根据权利要求1所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述培养的时间为13～15天。

5.根据权利要求1所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为7～9×105个/ml。

6.根据权利要求1所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述培养的过程中，在培养第0～7d，每2～3天补加前期补液培养基，以后每2～3天补加后期补液培养基；补液后始终保持细胞密度为7～9×105个/ml。

7.根据权利要求6所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述前期补液培养基包括：60～70ml/l人血浆、0.16～0.18μl/ml白细胞介素-10、0.2～0.4μl/ml白细胞介素-13和0.3～0.5μl/ml白细胞介素-18，其余为基础培养基。

8.根据权利要求6所述的一种提高nk细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述后期补液培养基包括：0.2～0.3μl/ml白细胞介素-10、0.5～0.6μl/ml白细胞介素-13和0.6～0.7μl/ml白细胞介素-18，其余为基础培养基。

9.权利要求1～8任一项所述的提高nk细胞杀伤活性的方法制备得到的nk细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌、慢性髓性白血病、结直肠癌或乳腺癌。

技术总结本发明涉及NK细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高NK细胞杀伤活性的方法。本发明提供了一种提高NK细胞杀伤活性的方法，包括如下步骤：(1)将外周血进行分离，得到PBMC细胞；(2)将所述PBMC细胞进行分离，得到NK细胞；(3)将NK细胞接种于NK细胞培养基进行培养。本发明方法在保证NK细胞高活率的同时，又能够使NK细胞快速大量扩增，可获得高纯度、高杀伤活性的NK细胞。技术研发人员：刘洋,郑荣杰,陈凤娇,王卿,赖文杰,陈慧明,叶茂受保护的技术使用者：广东壹加再生医学研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18