一种冬青叶近红外荧光成像探针制备方法及其应用

本发明涉及一种冬青叶近红外碳量子点(rcds)制备方法，及其作为长期荧光示踪成像探针应用在细胞和肿瘤长期荧光示踪中的。

背景技术：

1、恶性肿瘤(癌)是公认的最具挑战性的疾病之一，死亡率高，在我国发病率呈直线上升趋势，严重威胁着公众健康和生命安全,随着现代医学的快速发展，一些癌症可以被有效地诊断或治愈。目前，癌症的诊断方法主要有超声成像(ui)、单光子发射计算机断层成像(spect)、正电子发射断层成像(pet)、x射线计算机断层成像(ct)、磁共振成像(mri)等分子成像方法。此外，癌细胞很容易通过血液循环转移或转移到淋巴系统的其他部位，使癌症恶化，使治疗更具挑战性。化疗结合手术切除原发肿瘤及周围部分正常组织是常用的治疗方法。然而，肿瘤细胞的早期转移和扩散可能没有临床表现，肉眼或肿瘤诊断技术无法发现，导致部分癌症患者术后出现肿瘤复发和转移。因此，对肿瘤细胞和肿瘤生长进行有效的实时监测，也可以显著提高患者的癌症治疗和预后评估效果。

2、近年来，长期荧光示踪成像技术作为一种高灵敏度、无创的技术，由于能够可视化肿瘤位置和评估其生长过程，已被研究人员应用于癌症诊断、肿瘤生长监测、图像引导手术等领域。红发射发射荧光材料具有优异的光学性能，呈现出纳米材料独特的结构和尺寸特征。一方面，它们可以防止人体自身成千上万的干扰，加深渗透到组织的深度，迅速穿过细胞膜，延长在细胞内的停留时间。目前，它已受到肿瘤实时监测领域研究者的广泛关注。目前应用最广泛的荧光材料是有机荧光材料和无机量子点。然而，一些量子点对生物体的毒性更大，限制了它们在长期成像中的应用。红发射碳点(rcds)，其荧光发射光谱在650～900nm之间，辐射能较小，在此范围内的生物很少，生物体内的血红蛋白、水和脂类对这些光波的吸收很少。此外，rcds可以在深层组织中产生光信号，对组织本身的影响很小，避免了背景干扰，分析灵敏度高。特别是与cdte和cdse等环保材料相比，rcds已经应用于生物样品分析和跟踪等领域，在人体分析方面呈现出明显的优势。到目前为止，已经成功合成了许多rcds。然而，一些rcds存在一些缺点，如化学前体有毒，红发射区域荧光发射弱，后处理复杂，成本高。因此，开发一种更环保、更简单、成本更低、性能更优异的近红外荧光成像探针制备方法是十分必要和迫切的。

技术实现思路

1、本发明以生物质冬青叶提取物为前驱体，采用一步微波法成功制备了rcds。得到的生物质rcds发射波长为680nm，具有优良的生物相容性和稳定性、强荧光强度、能穿透较厚的组织，避免背景荧光的干扰以及吸收和发射波长之间的相互作用。基于这些优点，将生物质rcds作为长期荧光示踪探针应用于体外细胞成像、实时和长期示踪细胞，在体内可用于实时和长期示踪肿瘤生长。

2、一种冬青叶近红外荧光成像探针制备方法及其应用，其特征在于，该冬青叶近红外荧光成像探针溶液的制备方法包括如下步骤：

3、(1)rcds的制备：将新鲜冬青叶洗净晾干后，取适量的冬青叶浸入一定量无水乙醇中，连续搅拌2-5h，再在7000rpm转速下离心20min，得到绿色的上层清液，采用旋转蒸发器对上层清液进行浓缩，直至出现浆体样品，将浆体样品置于烧杯中，采用600-800w功率微波炉加热4-6min得到残渣，残渣分散于超纯水中得分散液，分散液通过0.22μm滤膜过滤器进一步过滤得到含小粒径的生物质rcds的滤液；

4、(2)冬青叶rcds在细胞示踪中的应用：取步骤(1)制备的生物质rcds的滤液适量，待贴壁hepg2细胞长满瓶底后，弃去旧的培养基，用pbs洗涤1-2次，将hepg2细胞接种于直径35mm的共聚焦细胞皿中，待细胞增殖至80％时，除去dmem培养液，添加50-100μl浓度为10μg/ml取步骤(1)制备的rcds的溶液，培养3-5h。然后除去培养液，用pbs缓冲液洗涤2-4次，加入0.6ml胰酶消化液消化1-3min，待细胞微微翘起变圆后，1000rpm离心2min，弃去消化液，加入新鲜的培养基吹打混匀，将细胞悬液稀释一半后接种于培养皿中继续放回37℃、5％co2的细胞培养箱中传代培养。在一定时间间隔内，使用胰酶消化液将细胞消化悬浮，用4％多聚甲醛固定15min，设定激发波长为514nm，使用激光共聚焦显微镜收集650nm处的荧光进行拍摄，观察细胞内荧光成像。

5、(3)冬青叶rcds在肿瘤示踪中的应用：hepg2细胞种于90mm直径的细胞培养皿内，置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养24h，待其贴壁后，将培养液换成50μl 5-15μg/ml步骤(1)制备的rcds的溶液培养3-5h。吸去含药培养液，使用胰酶消化液将细胞消化悬浮，900-1100rmp转速下离心1-3min，吸走上清液，加入dmem培养液轻轻吹打混匀。将hepg2细胞悬液通过皮下注射方式接种于裸鼠腿上部位(1×106个细胞/100μldmem溶液)。肿瘤细胞接种于裸鼠体内后，在指定的时间间隔内(第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第18天)，裸鼠使用异氟烷进行麻醉，设置激发波长为600nm，发射波长680nm，使用小动物活体成像仪对裸鼠进行活体成像实验，检测皮下注射部位的红发射成像效果。

6、(4)裸鼠离体脏器的荧光成像及苏木精-伊红(h&e)染色实验

7、体内肿瘤示踪实验结束后，将实验裸鼠经异氟烷麻醉处死后解剖，取出它们心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏以及肿瘤组织块，使用小动物活体成像仪对这些脏器以及肿瘤组织块进行荧光成像，同样采用600nm激发波长激发，680nm发射波长。

8、肿瘤示踪实验的裸鼠离体脏器心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏用于荧光成像实验后，用4％多聚甲醛固定24小时后，组织切片进行h&e染色实验，染色结果使用倒置显微镜拍摄。为了进一步验证生物质rcds对裸鼠的副作用低，取100μl 10-30μg/ml步骤(1)制备的rcds的溶液尾静脉注射入空白裸鼠体内，观察一周，然后将裸鼠处死，取出心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行h&e染色，观察其组织是否有凋亡或坏死现象。

9、优先地，所述步骤(1)中冬青叶与无水乙醇的比例为3g：6ml。

10、优先地，所述步骤(1)中的一种rcds制备方法中，搅拌时间为4h。

11、优先地，所述步骤(1)中的微波处理的条件：微波功率为700w，时间为5min。

12、优先地，所述步骤(2)中的培养液换成80μl 10μg/mlrcds的溶液培养4h。

13、优先地，所述步骤(2)中用pbs缓冲液洗涤3次，加入0.6ml胰酶消化液消化2min。

14、优先地，所述步骤(3)中将培养液换成50μl20μg/mlrcds的溶液培养4h。

15、优先地，所述步骤(3)中使用1000rmp转速下离心2min。

16、优先地，所述步骤(4)中取100μl20μg/mlrcds溶液尾静脉注射入空白裸鼠体内。

17、本发明所述的一种冬青叶近红外荧光成像探针制备方法及其应用具有如下优点：

18、(1)制备的冬青叶近红外荧光成像探针具有生物相容性和稳定性优良、荧光强度强、穿透力强等优点；

19、(2)制备的冬青叶近红外荧光成像探针应用于细胞成像、体外实时长期荧光示踪细胞、体内实时长期荧光示踪肿瘤生长，稳定性好，荧光强度强，荧光图像清晰；

20、(3)制备的冬青叶近红外荧光成像探针可作为一种细胞和肿瘤的长期有效荧光示踪成像探针应用于肿瘤引导手术，可广泛应用于肿瘤细胞可视化治疗等领域中。