一种内切型透明质酸裂解酶CpHyl8及其重组菌株和应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种内切型透明质酸裂解酶cphyl8及其重组菌株和应用。

背景技术：

1、透明质酸（ha）是一种由d-葡萄糖醛酸（glca）和n-乙酰-d-氨基葡萄糖（glcnac）通过β-1,3糖苷键形成二糖单元，再将二糖单元通过β-1,4糖苷键连接形成的非硫酸化线性糖胺聚糖（gag）。ha作为人体细胞外基质的基本组成部分，为ecm提供水合作用，并调节组织的平衡和抗压能力。

2、透明质酸酶是一类可以通过特异性水解或裂解β-1,3糖苷键或β-1,4糖苷键来降解ha的酶。它在临床上主要用于辅助药物扩散或递送、外渗管理以及对注射ha填充剂相关并发症的处理。目前临床用透明质酸酶主要为cho细胞表达的重组人透明质酸酶rhuph20，被专利保护且生产成本高。而从动物组织中提取的透明质酸酶bth等纯度低且容易引起过敏反应。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种内切型透明质酸裂解酶cphyl8及其重组菌株和应用。本发明所述的内切型透明质酸裂解酶活性高，具有专一性降解透明质酸的底物特异性并且具有较高的降解活性，具有良好的市场应用前景。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其氨基酸序列如seq id no.6所示。

4、进一步的，编码所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的适合反应温度为40-55℃。

6、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的最适反应温度为50℃。

7、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的适合反应ph为5.6-6.6。

8、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的最适反应ph为6.0。

9、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8在ph 4.0-7.0具有很好的稳定性。

10、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8在0-50℃下具有很好的稳定性。

11、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的适合反应nacl浓度为0-0.2 m。

12、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的最适反应nacl浓度为0 m。

13、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8对透明质酸具有底物特异性，能够特异性地降解透明质酸，对硫酸软骨素的活性都较低。

14、进一步的，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的降解方式为内切型，其最终降解产物为不饱和二糖。

15、本发明还提供了包含所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8编码基因的重组表达载体。

16、进一步的，所述重组表达载体为pet-28a (+)载体。

17、本发明还提供了包含所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8编码基因的重组菌株。

18、进一步的，所述重组菌株为大肠杆菌bl21(de3)。

19、进一步的，所述的内切型透明质酸裂解酶cphyl8的制备方法为：将所述重组菌株接种到培养基中37℃培养，培养至od600为0.4~0.6时，加入iptg使其终浓度为0.25 mm，18℃诱导48 h；菌体离心去上清，沉淀重悬后破碎，再离心收集上清液得到粗酶液；使用镍离子亲和柱将粗酶液分离纯化获得所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8。

20、本发明还提供了所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8在用于制备降解透明质酸的酶制剂中的应用。

21、与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

22、本发明所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8可以利用含有 cphyl8编码基因的重组菌体通过培养、诱导和分离纯化获得，而cphyl8编码基因则是通过原始透明质酸裂解酶基因进行去除信号肽和锚定蛋白序列优化而来，优化后透明质酸裂解酶具有更好的蛋白表达量。该酶的最适反应温度50℃，且在0-50℃下具有良好的稳定性，并且该酶的降解方式为内切型，最终降解产物为不饱和二糖。另外，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的最适ph为6.0，在ph 4.0-7.0具有较好的稳定性，其同时对透明质酸具有特异性，而且所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8对透明质酸降解速率高，能够快速产生不饱和二糖。本发明还构建了含上述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的重组载体和重组菌体，并且确定了其酶学性质和降解速率，能够为其作为皮下扩散剂提供了良好的基础。

技术特征：

1.一种活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的氨基酸序列如seq id no.6所示。

2.根据权利要求1所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，编码所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.5所示。

3.根据权利要求1所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的适合反应温度为50℃。

4.根据权利要求1所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的适合反应ph为6.0。

5.根据权利要求1所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的适合反应nacl浓度为0 m。

6.根据权利要求1所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8具有明显降解透明质酸的作用。

7.根据权利要求1所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8，其特征在于，所述内切型透明质酸裂解酶cphyl8的降解方式为内切型，其最终降解产物为不饱和二糖。

8.包含权利要求2所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8编码基因的重组表达载体。

9.包含权利要求2所述活性高的内切型透明质酸裂解酶cphyl8编码基因的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌bl21(de3)。

10.权利要求1-7任一项所述的内切型透明质酸裂解酶cphyl8在用于制备降解透明质酸的酶制剂中的应用。

技术总结本发明公开了一种活性高的内切型透明质酸裂解酶CpHyl8及其重组菌株和应用。本发明所述内切型透明质酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，编码氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。所述内切型透明质酸裂解酶的适合反应温度为50℃，且在0‑50℃时具有高稳定性，因此该酶可在较高温度下有效降解底物，属于一种热稳定的透明质酸裂解酶。所述内切型透明质酸裂解酶对透明质酸具有特异性，对硫酸软骨素的活性较低，降解方式为内切型，最终降解产物为不饱和二糖，NaCl对其活性有抑制作用。本发明还构建了含所述内切型透明质酸裂解酶CpHyl8编码基因的重组载体和重组菌体，能够为其作为皮下扩散剂应用提供了良好的基础。技术研发人员：于文功,韩峰,付永青,傅政,余静,王海楠受保护的技术使用者：中国海洋大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18