一种鸭坦布苏病毒减毒株及其应用

本发明涉及生物医药，具体地，涉及一种鸭坦布苏病毒减毒株及其应用。

背景技术：

1、鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus，dtmuv)感染是水禽的一种急性、高热性传染病，可引起鸭产蛋量下降、采食量下降和瘫痪等，死亡率为5％～30％；dtmuv可感染多种鸟类，包括鸭、鸡、鹅、鸽子和麻雀等，其中鸭是最易感的动物之一。因此，鸭坦布苏病毒感染已严重威胁养鸭业的健康发展。

2、目前，dtmuv的防控以灭活疫苗和弱毒疫苗免疫为主。但是，灭活疫苗仅能诱导体液免疫应答，免疫效果有限；弱毒疫苗均为鸭胚、鸡胚和细胞传代致弱苗，生产周期长，不足以应对突发疫情，而利用反向遗传技术获得的dtmuv基因工程减毒活疫苗，能够同时诱导体液免疫和细胞免疫应答，且生产周期短，能够弥补传统dtmuv疫苗的不足。基因工程减毒活疫苗也可作为病毒活载体，进而嵌合其他病毒的抗原蛋白或抗原表位，用于研制预防疾病的活载体疫苗。

3、h5n6亚型禽流感病毒是我国流行的禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)之一，感染该病毒的家禽死亡率高达100％，并且h5n6亚型禽流感病毒还能感染人，该病毒严重威胁养禽业的发展以及公共卫生安全。目前h5n6亚型禽流感病毒防控主要以灭活疫苗为主，但灭活疫苗仅能诱导体液免疫应答，无法诱导机体产生细胞免疫应答；并且目前未见以鸭坦布苏病毒疫苗株作为活载体进而研发禽流感疫苗的报道。

4、因此，目前急需一种鸭坦布苏病毒的减毒疫苗株，以弥补现有坦布苏疫苗的不足，并利用鸭坦布苏病毒的减毒疫苗株研制嵌合禽流感抗原表位的活载体疫苗，以作为现有禽流感疫苗的一种补充疫苗，用于防控禽流感。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种鸭坦布苏病毒减毒株及其应用。

2、本发明的第一目的是提供一种鸭坦布苏病毒减毒株。

3、本发明的第二目的是提供上述鸭坦布苏病毒减毒株在制备用于免疫鸭坦布苏病毒的疫苗中的应用。

4、本发明的第三目的是提供上述鸭坦布苏病毒减毒株在制备活载体疫苗毒株中的应用。

5、本发明的第四目的是提供一种鸭坦布苏病毒减毒株的制备方法。

6、本发明的第五目的是提供一种活载体疫苗毒株的制备方法。

7、本发明的第六目的是提供上述制备方法制备得到的活载体疫苗毒株。

8、本发明的第七目的是提供上述活载体疫苗毒株在制备活载体疫苗中的应用。

9、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

10、一种鸭坦布苏病毒减毒株，所述鸭坦布苏病毒减毒株的核苷酸序列如seq id no：1所示。

11、本发明还请求保护上述鸭坦布苏病毒减毒株在制备用于免疫鸭坦布苏病毒的疫苗中的应用。

12、本发明还请求保护上述鸭坦布苏病毒减毒株在制备活载体疫苗毒株中的应用。

13、优选地，所述活载体疫苗毒株为针对禽流感病毒的活载体疫苗毒株。

14、更优选地，所述禽流感病毒为h5n6亚型禽流感病毒。

15、本发明还请求保护一种鸭坦布苏病毒减毒株的制备方法，包括以下步骤：

16、s1.以野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒pb-s132-a-h为模板，使用核苷酸序列如seq id no：2所示的em-1上游引物和核苷酸序列如seq id no：3所示的em-1下游引物进行扩增得到em-1片段，使用核苷酸序列如seq id no：4所示的em-2上游引物和核苷酸序列如seq id no：5所示的em-2下游引物进行扩增得到em-2片段；

17、以em-1片段和em-2片段作为模板，使用核苷酸序列如seq id no：2所示的em-1上游引物和核苷酸序列如seq id no：5所示的em-2下游引物进行扩增得到em片段；

18、s2.以步骤s1得到的em片段作为模板，使用核苷酸序列如seq id no：6所示的emt-1上游引物和核苷酸序列如seq id no：7所示的emt-1下游引物进行扩增得到emt-1片段，使用核苷酸序列如seq id no：8所示的emt-2上游引物和核苷酸序列如seq id no：9所示的emt-2下游引物进行扩增得到emt-2片段；

19、以emt-1片段和emt-2片段作为模板，使用核苷酸序列如seq id no：6所示的emt-1上游引物和核苷酸序列如seq id no：9所示的emt-2下游引物进行扩增，得到emt片段；

20、s3.以步骤s2得到的emt片段作为模板，使用核苷酸序列如seq id no：10所示的esmt-1上游引物和核苷酸序列如seq id no：11所示的esmt-1下游引物进行扩增，得到esmt-1片段，使用核苷酸序列如seq id no：12所示的esmt-2上游引物和核苷酸序列如seqid no：13所示的esmt-2下游引物进行扩增得到esmt-2片段；

21、以esmt-1片段和esmt-2片段作为模板，使用核苷酸序列如seq id no：10所示的esmt-1上游引物和核苷酸序列如seq id no：13所示的esmt-2下游引物进行扩增得到esmt片段；

22、s4.利用xba i内切酶和xho i内切酶对野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒pb-s132-a-h进行酶切，得到线性化的pb-s132-a-h；

23、将步骤s3得到的esmt片段同源重组至线性化的pb-s132-a-h中，得到重组质粒pb-rs132-esmt；

24、s5.将步骤s4得到的重组质粒pb-rs132-esmt转染至细胞中，收集病毒液即得核苷酸序列如seq id no：1所示的鸭坦布苏病毒减毒株。

25、其中，步骤s1中所述野生型鸭坦布苏病毒s132全长cdna感染性克隆质粒pb-s132-a-h公开于现有技术cn116837028a。

26、优选地，步骤s5中所述细胞为bhk-21细胞。

27、本发明基于反向遗传技术构建了一种鸭坦布苏病毒减毒株，并将其作为活载体研制了嵌合病毒抗原的活载体疫苗毒株。

28、本发明还请求保护一种活载体疫苗毒株的制备方法，具体如下：

29、利用pac i内切酶和xba i内切酶对上述重组质粒pb-rs132-esmt进行酶切，得到线性化的pb-rs132-esmt；

30、将核苷酸序列如seq id no：14所示的px-habnpt序列同源重组至线性化的pb-rs132-esmt中，得到重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒pb-rs132-esmt-habnpt；

31、利用重组鸭坦布苏病毒全长cdna感染性克隆质粒pb-rs132-esmt-habnpt转染细胞后，收集病毒液，即得活载体疫苗毒株。

32、本发明还请求保护上述制备方法制备得到的活载体疫苗毒株。

33、优选地，所述活载体疫苗毒株的核苷酸序列如seq id no：15所示。

34、本发明还请求保护上述活载体疫苗毒株在制备活载体疫苗中的应用。

35、优选地，所述活载体疫苗为针对禽流感病毒的活载体疫苗。

36、更优选地，所述禽流感病毒为h5n6亚型禽流感病毒。

37、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

38、本发明提供了一种鸭坦布苏病毒减毒株，所述鸭坦布苏病毒减毒株的核苷酸序列如seq id no：1所示。所述鸭坦布苏病毒减毒株能够免疫雏鸭并使得雏鸭产生有效的鸭坦布苏病毒抗体，对于雏鸭的保护率达到了100％，同时雏鸭的体重增长未受到影响，未出现排毒、死亡和病毒血症，且雏鸭的主要脏器中未检测到鸭坦布苏病毒。所述鸭坦布苏病毒减毒株还能够作为活载体嵌合h5n6亚型禽流感病毒抗原表位进而构建活载体疫苗毒株，所述活载体疫苗毒株能够免疫雏鸭并有效降低h5n6亚型禽流感病毒对雏鸭的损伤。