一种末端修复驱动的二次体外转录机器用于单分子检测人类癌症中碱性磷酸酶水平

本发明涉及一种末端修复驱动的二次体外转录机器用于单分子检测人类癌症中碱性磷酸酶水平，属于生物分析。

背景技术：

1、碱性磷酸酶(alp)是一种重要的单磷酸水解酶，以不同水平广泛分布于人体组织中。alp可以催化核酸、蛋白质和碳水化合物中磷酸基团的水解，在多种生物过程(如细胞代谢、分子运输和信号转导)中发挥关键的调节作用。正常成年人血清中alp的平均水平为40-150u/l，alp水平异常可能诱发多种人类疾病和癌症。低水平的alp与各种代谢紊乱相关，包括白血病、再生障碍性贫血和wilson病。相反，高水平的alp与骨疾病(如骨软化症和成骨细胞肿瘤)和癌症(如口腔癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌)有关。此外，由于高催化活性和广泛的底物特异性，alp经常被用作分子监测、组织化学染色和基因表达分析中的标记示踪剂。因此，特异地和高灵敏地检测alp对生物医学研究和癌症诊断治疗具有重要意义。

2、t7体外转录扩增是一种新的不依赖模板/引物的rna扩增技术，即在t7启动子存在下，t7 rna聚合酶在5′-3′方向上等温合成rna片段。t7体外转录扩增具有高产率、高保真、灵活序列设计、快速酶动力学以及不涉及热循环仪等特点，已广泛应用于等温核酸扩增和生物传感中。最近，单分子检测已成为一种强大的分析技术，可灵敏地检测各种生物标志物(如核酸、蛋白酶和表观遗传变化等)，具有低样本损耗和信噪比高的优势。

3、alp检测的传统方法包括比色法、电化学法、表面增强共振拉曼散射法和核磁共振/磁共振成像法。以上每一种方法都有自己的特点，但通常涉及复杂的纳米材料制备、繁琐的操作、特殊的设备和耗时耗力的程序。鉴于简单、快速和稳定的优点，荧光法被引入alp检测方法中，且其主要分为基于荧光材料和基于小分子荧光探针两大类。基于荧光材料的荧光法有依赖于碳量子点、硼掺杂的石墨烯量子点、铜纳米颗粒和金/银纳米团簇；而基于小分子荧光探针荧光法有甜菜碱改性的聚乙烯亚胺和双光子荧光探针。然而，在这些方法中，荧光信号会受到多种因素的影响(如激发、光漂白和发射收集等)。另外，所有上述alp方法都依赖于小分子底物的去磷酸化，而不涉及循环核酸复制介导的信号放大。为了提高灵敏度，构建了以5′-磷酸dna链为大分子底物，去磷酸化介导的分子信标树状纳米自组装用于一步检测alp，但分子信标的合成成本较高且组装过程需要时间长。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的问题，本发明构建了一种末端修复驱动的二次体外转录机器用于单分子检测人类癌症中碱性磷酸酶水平。基于alp催化去磷酸的高特异性、体外二次转录级联的高扩增效率和单分子检测的高信噪比，该方法对alp的检测限可分别达到体外7.93×10-8u/μl和体内1个细胞。此外，它还可用于评估动力学参数，筛选潜在的抑制剂和定量复杂生物样品(如各种癌细胞和人血清)中的alp水平。重要的是，该方法可以在一个试管中等温、快速实施，无需任何繁琐的程序、复杂的合成和高的样品消耗。

2、本发明的第一个目的是提供一种末端修复驱动的二次体外转录机器用于单分子检测人类癌症中碱性磷酸酶水平，可进一步应用于测定alp在不同癌细胞中的表达水平，为alp相关的生物医学研究、抗癌药物发现提供了一个简单而强大的平台。

3、为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

4、一种末端修复驱动的二次体外转录机器的制备方法，该方法具体步骤如下：

5、(1)hplc-纯化的寡核苷酸hp1、hp2生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

6、用1×tris-edta缓冲液分别将上述合成的寡核苷酸hp1、hp2进行稀释，以制备得到10mm hp1储备溶液和10mm hp2储备溶液；

7、将10mm的上述hp1储备溶液和10mm的上述hp2储备溶液分别在95℃的杂交缓冲液中孵育5min，然后冷却至25℃以形成完美的发夹结构，即hp1溶液和hp2溶液。

8、(2)alp-缓冲液的制备：将浓度分别为：0.1u/μl、0.01u/μl、0.001u/μl、10-4u/μl、10-5u/μl、5×10-6u/μl、10-6u/μl、5×10-7u/μl、10-7u/μl的alp溶液和0.5μl的10×cutsmart缓冲液混合后得到的；

9、将150nm步骤(1)得到的hp1溶液加入到5μl上述alp-缓冲液中，然后分别在37℃下孵育30min，以进行alp催化的hp1中3′-po4基团的去除。其中，cutsmart缓冲液是一种由100mm乙酸镁(mg(ac)2)、500mm乙酸钾(kac)、200mm乙酸三酯(tris-ac)、1mg/ml牛血清白蛋白(bsa,ph 7.9)组成的溶液。

10、(3)向步骤(2)的去磷酸化后所得产物中，依次加入1.2μl浓度为10μm hp2溶液、1μl浓度为10μm信号探针、1μl浓度为50u/μlt7 rna聚合酶、0.5μl浓度为40u/μltaq dna连接酶、0.7μl浓度为1u/μl dsn、0.5μl浓度为40u/μl rnase、0.8μl浓度为25mm ntps、2μl 10×rnapol缓冲液、2μl 10×taq dna连接酶反应缓冲液和2μl的10×dsn缓冲液，3.3μl depc,然后在37℃下孵育60min，以进行末端修复驱动的二次体外转录机器并释放fam荧光团。

11、在本发明的一种实施方式中，步骤(3)为，去磷酸化后，将所得产物加入15μl反应混合物(600nm hp2、500nm信号探针、50u t7 rna聚合酶、20u taq dna连接酶、0.7u dsn、20u rnase、500μm ntps、2μl 10×rnapol反应缓冲液、2μl 10×taq dna连接酶反应缓冲液和2μl的10×dsn缓冲液)中，然后在37℃下孵育60min，以进行末端修复驱动的二次体外转录机器以释放fam荧光团。rnapol反应缓冲液为t7 rna聚合酶产品中自带的反应缓冲液。taq dna连接酶是一款耐热连接酶，能够催化两条相邻dna链的5′-磷酸末端和3′-羟基末端形成磷酸二酯键。taq dna连接酶反应缓冲液为taq dna连接酶产品中自带的反应缓冲液。dsn是双链特异性核酸酶(dsn)是从红王蟹的肝胰腺中纯化的一种酶。dsn切割dna-rna杂交双链体中的dna，且能够区分完全匹配和不完全匹配的短dna双链体。dsn缓冲液为根据产品说明自己配置的dsn的反应缓冲液。rnase抑制剂特异性抑制rnasea、b和c的活性，在各种反应条件下保护rna，可用于核糖核酸酶的体外抑制，包括cdna合成、rt-pcr以及体外转录和翻译等程序。ntps是核糖核苷酸三磷酸的等摩尔缓冲溶液(ratp、rctp、rgtp和rutp)。

12、在本发明的一种实施方式中，rnapol反应缓冲液为t7 rna聚合酶产品中自带的反应缓冲液。rnapol缓冲液包括400mm tris-hcl、60mm mgcl2、20mm亚精胺、100mm二硫苏糖醇(dtt),ph＝7.9。在本发明的一种实施方式中，dsn缓冲液成分为500mm tris-hcl、50mmmgcl2、10mm dtt,ph＝8.0。taq dna连接酶缓冲液包括200mm tris-hcl、250mm kac、100mmmg(ac)2、10mm nad 1、100mm dtt、1％triton x-100,ph＝7.3。

13、本发明的提供一种末端修复驱动的二次体外转录检测碱性磷酸酶的试剂盒。

14、本发明提供一种上述二次体外转录机器或试剂盒在单分子检测人类癌症中碱性磷酸酶水平的应用。所述应用以非疾病的诊断与治疗为目的。

15、本发明基于一种用于人类癌症中碱性磷酸酶水平单分子检测的末端修复驱动的二次体外转录机器，最低检测限可达到7.93×10-8u/μl。

16、所述杂交缓冲液包括1.5mm mgcl2,10mm tris-hcl,ph 8.0；所述rnapol缓冲液包括400mm tris-hcl,60mm mgcl2,20mm亚精胺,100mm dtt,ph 7.9；所述dsn缓冲液成分为500mm tris-hcl,50mm mgcl2,and 10mm dtt,ph 8.0；所述taq dna连接酶缓冲液包括200mm tris-hcl,250mm kac,100mm mg(ac)2,10mm nad 1,100mm dtt,1％triton x-100,ph 7.3。

17、一种所述末端修复驱动的二次体外转录机器用于单分子检测人类癌症中碱性磷酸酶水平，其特征是，该方法应用于灵敏地检测alp，最低检测限可达到7.93×10-8u/μl。灵敏度比比率荧光法得到的值(1×10–4u/μl)高1261.0倍，比基于聚集的荧光法得到的值高12.6倍，比基于分子信标的树枝状纳米组装的荧光法得到的值(3.2×10–7u/μl)高4.03倍，与基于金纳米簇的荧光法得到的值(1.6×10–7u/μl)相当。

18、本发明还提供了一种用于检测人类癌症中碱性磷酸酶水平的生物传感器，所述传感器包括：发夹探针1(hp1)、发夹探针2(hp2)、信号探针、t7 rna聚合酶、taq dna连接酶、dsn、ntps、rnase；将发夹探针1(hp1)和样品溶液混合以进行alp催化的hp1中3′-po4基团的去除，去磷酸化后，依次添加发夹探针2(hp2)、信号探针、t7 rna聚合酶、taq dna连接酶、dsn、ntps、rnase进行孵育后，检测样品中的碱性磷酸酶水平；

19、所述hp1序列为：5′-ctg ttc gtg ttt tac ttg cct gtg aag ttt ttt ttt cttcacagg caagt-p-3′；

20、所述hp2序列为：5′-p-aaaaca cgaaca ggc aac caa ccc tatagt gag tcgtattat ttt ttaatacgactc actataggg-3′；

21、所述探针信号探针序列为：5′-bhq1-aag taaaacacgaacagg caac-fam-3′；

22、在发夹探针hp1和hp2中，“p”表示磷酸基团修饰；在信号探针中，3′端和5′端分别用fam和bhq1修饰。

23、在本发明的一种实施方式中，所述发夹探针1(hp1)、发夹探针2(hp2)添加的浓度比为：1：4。

24、在本发明的一种实施方式中，所述信号探针的添加浓度为：500nm，所述t7 rna聚合酶添加量为：50u，所述taq dna连接酶添加量为：20u，所述dsn添加量为：0.7u，所述ntps添加量为：500μm，所述rnase添加量为：20u。

25、本发明还提供了一种非诊断目的的利用上述生物传感器的碱性磷酸酶检测方法，所述方法包括以下步骤：

26、(1)将样品溶液和所述发夹探针1(hp1)进行孵育；以进行alp催化的hp1中3′-po4基团的去除；

27、(2)去磷酸化后，依次添加所述发夹探针2(hp2)、所述信号探针、t7 rna聚合酶、taq dna连接酶、dsn、ntps、rnase进行孵育后，检测样品中的碱性磷酸酶水平。

28、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中的孵育条件：37℃条件下孵育60min。

29、在本发明的一种实施方式中，所述发夹探针1(hp1)、发夹探针2(hp2)添加的浓度比为：1：4；所述信号探针的添加浓度为：500nm，所述t7 rna聚合酶添加量为：50u，所述taqdna连接酶添加量为：20u，所述dsn添加量为：0.7u，所述ntps添加量为：500μm，所述rnase添加量为：20u。

30、在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述样品溶液为，样品同10×cutsmart缓冲液混和后得到的；所述10×cutsmart缓冲液的添加量为：2μl。

31、在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，还包括10×rnapol缓冲液、10×taq dna连接酶反应缓冲液、10×dsn缓冲液、depc；优选的，所述10×rnapol缓冲液的添加量为：2μl；所述10×taq dna连接酶反应缓冲液的添加量为：2μl；所述10×dsn缓冲液的添加量为：2μl；所述depc添加量为：3.3μl。

32、本发明还提供了上述生物传感器在制备检测碱性磷酸酶水平的试剂盒中的应用。

33、本发明还提供了上述生物传感器或上述检测方法在检测碱性磷酸酶水平中的应用，所述应用以非疾病的诊断与治疗为目的。

34、有益效果

35、基于alp催化去磷酸的高特异性、二次体外转录级联的高扩增效率和单分子检测的高信噪比，该方法表现出良好的特异性和超高的灵敏度。重要的是，它可以用于评估动力学参数，筛选潜在的抑制剂，甚至量化各种癌细胞和人类血清中的alp水平。它的明显优势表现为：(1)选择5′-磷酸核苷酸作为大分子底物，使靶信号转化为放大的rna转录信号；

36、(2)alp催化去磷酸化和t7转录扩增的高特异性，赋予该方法较高的选择性；

37、(3)二次体外转录级联的高扩增效率，赋予该方法较高的灵敏度，最低体外检测限可低至7.93×10-8u/μl，体内检测限可低至1个细胞；

38、(4)单分子检测的高信噪比，赋予该方法超低的背景信号；

39、(5)该方法可在一个试管中等温、快速进行，无需繁琐的程序、复杂的合成和高的样品消耗，大大简化了实验程序，在磷酸酶相关的生物医学研究、临床诊断和抗癌药物开发中具有应用前景。