核酸分子、包含其的重组杆状病毒及其应用的制作方法

本技术属于生物医药领域，具体涉及改造病毒载体技术，特别涉及一种核酸分子、包含其的重组杆状病毒及其应用。

背景技术：

1、昆虫细胞表达系统(即重组杆状病毒表达系统)是一种真核表达系统，可以在昆虫细胞中表达包括真菌、细菌、病毒和植物在内的多种物种的外源基因。昆虫细胞表达系统具有重组蛋白表达量高、蛋白翻译后修饰较为全面、适合大规模生产、生产成本较低等优势，已被广泛用于多种重组蛋白的表达、药物研发以及药物和疫苗等的商业化生物制品的生产。

2、传统的重组杆状病毒表达系统中，广泛采用bac-to-bac系统，该系统最早的开发者luckow等选用杆状病毒的复制非必须基因多角体基因(polyhedron,polh)位点作为tn7转座子的重组位点，外源基因选择插入这个基因座通常能够获得很高的表达水平(luckow等,1993,j.virol.67(8):4566-4579)。有研究报道昆虫杆状病毒表达系统中的bev在传代过程中，会产生丢失部分基因的缺陷干扰病毒，缺陷干扰病毒在传代过程中逐渐占据比例优势，导致外源基因表达下降(pijlman等,j gen virol,2003,84:2041-2049)。外源基因在bev基因组中的不稳定因素，包括外源基因自身的不稳定性、dna片段的插入、插入的位点以及不同细胞环境对缺陷病毒的选择性等(willemsen等,virus evol,2019,5(2):vez045)。有研究报道bac to bac系统中tn7转座子由原来的polh位点置换到新的插入位点odv-e56基因座时，所获得的bev能够高表达外源基因，尤其值得的注意的是该bev连续传代的稳定性有显著增强(pijlman等,j genvirol,2003,84:2669-78)。另外有研究表明传统的基于穿梭质粒的一杆状病毒系统，在穿梭质粒上同时容纳rep基因、cap基因和itr核心表达元件，稳定性较差，该高度整合的重组杆状病毒bev只能够稳定传代4代，第5代后bev制备raav的产率会显著降低(参考yang等,2018,mol ther methods clin dev.2018jul 4；10:38-47.)。

3、鉴于上述背景，为实现插入外源基因的长期稳定传代，目前仍需筛选新的bev基因组中的有效插入位点。

技术实现思路

1、基于此，本技术一个或者多个实施例提供一种核酸分子、包含其的重组杆状病毒及其应用。技术方案包括：

2、本技术的一个或者多个实施例提供一种核酸分子，所述核酸分子包括：核酸片段1、核酸片段2和位于所述核酸片段1及所述核酸片段2之间的用于表达外源片段的外源基因表达框；

3、所述核酸片段1和所述核酸片段2的互补片段为尾对尾基因对；

4、所述核酸片段1和所述核酸片段2与非编码区域相连接，所述非编码区域的5’末端为taa且3’末端为tta，taa和tta之间插入有所述外源片段。

5、在本技术的一些实施方式中，所述非编码区域的序列为taatta，taa和tta之间插入有所述外源片段。

6、在本技术的一些实施方式中，所述非编码区域的序列的长度为7bp-200bp。

7、在本技术的一些实施方式中，所述尾对尾基因对来自杆状病毒。

8、在本技术的一些实施方式中，所述尾对尾基因对来自如下任一种杆状病毒：

9、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、家蚕核型多角体病毒、黄杉毒蛾多核衣壳核型多角体病毒、舞毒蛾多核衣壳核型多角体病毒、甜菜夜蛾多核衣壳核型多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒以及斜纹夜蛾核型多角体病毒。

10、在本技术的一些实施方式中，所述尾对尾基因对来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。

11、在本技术的一些实施方式中，所述尾对尾基因对均为杆状病毒保守基因。

12、在本技术的一些实施方式中，所述外源片段包括选择标记基因和目标基因中的一种或者多种。

13、在本技术的一些实施方式中，所述目标基因包括aav包装必需元件，所述aav包装必需元件包括cap基因、rep基因以及itr基因中的一种或者多种；

14、在本技术的一些实施方式中，所述itr基因的左侧itr片段和右侧itr片段之间插入有goi。

15、在本技术的一些实施方式中，所述外源基因表达框包括调控所述选择标记基因的启动子包括杆状病毒极早期启动子。

16、在本技术的一些实施方式中，所述外源基因表达框包括调控所述目标基因的启动子包括p10启动子或ph启动子。

17、在本技术的一些实施方式中，所述选择标记基因包括荧光素酶基因、新霉素抗性基因、潮霉素磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、谷氨酰胺合成酶基因、天冬酰胺合成酶基因、色氨酸合成酶基因、组氨醇脱氢酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、色氨酸合成酶基因中的一种或者多种。

18、在本技术的一些实施方式中，所述选择标记基因为荧光素酶基因。

19、在本技术的一些实施方式中，所述目标基因编码抗体、多肽、酶、激素、生长因子和受体中的一种或者多种。

20、在本技术的一些实施方式中，所述尾对尾基因对包括如下基因对中的任意一对：

21、基因对1为lef4基因和orf91基因，对应的插入位点记作ob1位点；

22、基因对2为p15基因和cg30基因，对应的插入位点记作ob2位点；以及，

23、基因对3为env-prot基因和pkip基因，对应的插入位点记作ob3位点。在本技术的一些实施方式中，所述非编码区域的序列包括如seq id no.1所示的序列。

24、在本技术的一些实施方式中，所述核酸分子的序列如seq id no.44中第2779bp至第4912bp所示、seq id no.46中第2779bp至第11984bp所示、seq id no.47中第2779bp至第8988bp所示、seq id no.48中第2903bp至第8875bp所示、seq id no.49中第2861bp至第8881bp所示、seq id no.50中第749bp至第4910bp所示、seq id no.52中第749bp至第4776bp所示或者seq id no.53中第2903bp至第6930bp所示。

25、本技术的一个或者多个实施例还提供一种重组质粒，所述重组质粒包括所述的核酸分子。

26、在本技术的一些实施方式中，所述重组质粒包括穿梭质粒。

27、在本技术的一些实施方式中，所述重组质粒如seq id no.15、seq id no.44、seqid no.46、seq id no.47、seq id no.48、seq id no.49、seq id no.50、seq id no.52或者seq id no.53所示。

28、本技术的一个或者多个实施例还提供一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒的基因组包括所述的核酸分子。

29、在本技术的一些实施方式中，所述重组杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、家蚕核型多角体病毒、黄杉毒蛾多核衣壳核型多角体病毒、舞毒蛾多核衣壳核型多角体病毒、甜菜夜蛾多核衣壳核型多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒或者斜纹夜蛾核型多角体病毒。

30、在本技术的一些实施方式中，基因组存在chia基因和cath基因中的一个或者多个的缺失。

31、在本技术的一些实施方式中，所述重组杆状病毒的基因组的其他基因座插入有如上定义的外源片段。

32、在本技术的一些实施方式中，所述选择标记基因插在所述ob1位点、所述ob2位点和所述ob3位点中的任一位点。

33、本技术的一个或者多个实施例还提供一种所述重组杆状病毒的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

34、使供体质粒和杆状病毒基因组发生同源重组，从而构建重组杆状病毒；

35、所述供体质粒包括所述的核酸分子。

36、在本技术的一些实施方式中，同源重组采用的重组酶包括red重组酶、bxb1整合酶、φc31整合酶、cre重组酶或者flp重组酶。

37、在本技术的一些实施方式中，所述供体质粒包括穿梭质粒。

38、在本技术的一些实施方式中，所述供体质粒如seq id no.15、seq id no.44、seqid no.46、seq id no.47、seq id no.48、seq id no.49、seq id no.50、seq id no.52或者seq id no.53所示。

39、本技术的一个或者多个实施例还提供一种腺相关病毒包装载体系统，其包括aav包装必需元件，所述aav包装必需元件包括cap基因、rep基因以及itr基因中的一种或者多种；所述aav包装必需元件位于相同或者不同的所述的核酸分子中。

40、在本技术的一些实施方式中，所述itr基因的左侧itr片段和右侧itr片段之间插入有goi。

41、本技术的一个或者多个实施例还提供一种外源片段的表达产物的生产方法，所述生产方法包括如下步骤：

42、用所述重组杆状病毒感染宿主细胞后培养，从所得培养产物中分离所述外源片段的表达产物。

43、在本技术的一些实施方式中，所述宿主细胞包括昆虫细胞系。

44、在本技术的一些实施方式中，所述昆虫细胞系包括鳞翅目昆虫细胞系。

45、在本技术的一些实施方式中，所述鳞翅目昆虫细胞系包括草地贪夜蛾细胞系、家蚕细胞系或者粉纹夜蛾细胞系。

46、在本技术的一些实施方式中，所述鳞翅目昆虫细胞系包括卵巢组织细胞系或者脂肪体细胞系。

47、在本技术的一些实施方式中，所述生产方法还包括检测所得重组杆状病毒的滴度的步骤。

48、在本技术的一些实施方式中，采用标准曲线法检测所得重组杆状病毒的滴度，包括如下步骤：

49、提供标准曲线，所述标准曲线反映荧光素酶的活性值和病毒滴度值的线性关系；以及，

50、检测待测重组杆状病毒中所述荧光素基因表达的荧光素酶的活性值，代入所述标准曲线，计算所述待测重组杆状病毒的病毒滴度值；

51、其中，所述荧光素酶的活性值＝重组杆状病毒表达荧光素酶催化产生的发光强度值-无病毒对照品的发光强度值。

52、本技术的一个或者多个实施例还提供一种重组腺相关病毒或者goi表达产物的生产方法，所述生产方法采用所述的腺相关病毒包装载体系统。

53、相对于传统技术，本技术的有益效果包括：

54、本技术在杆状病毒基因组上发现了新的外源片段的插入位点，在这些插入位点插入外源片段，不影响杆状病毒复制且传代稳定，为杆状病毒表达系统中的bev基因组中的有效插入提供新的选择。