一种基于酶促重组等温扩增检测粪便SFRP2、SEPTIN9DNA甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种基于酶促重组等温扩增检测粪便sfrp2、septin9 dna甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法。

背景技术：

1、目前，粪便甲基化技术存在一些挑战，如粪便甲基化处理耗时费力，且粪便中的多种抑制物会对其产生干扰，使得粪便核酸提取变得耗时、费力和效率低下；此外，甲基化检测需要专门的仪器设备和人员、检测时间长和费用昂贵，不能满足普通民众的需求。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中的不足之处，本发明提供一种基于酶促重组等温扩增检测粪便sfrp2、septin9 dna甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，其克服现有技术中粪便甲基化检测耗时、费力、复杂、费用高的难题。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、1、一种基于酶促重组等温扩增检测粪便sfrp2、septin9 dna甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，其特征在于：包括以下步骤，

4、s1、样本处理，收集粪便样本，通过加热裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱得到扩增产物；

5、s2、核酸甲基化，将磁棒取出放入有洗脱液的自热管中，温度达到95℃，变性5min，使dna变为单链，再次用新的磁棒吸附洗脱液，将磁棒放入有亚硫酸氢盐的处理管中16h，最后通过洗涤、洗脱，得到甲基化处理后的核酸；

6、s3、引物设计，设计sfrp2和septin9的甲基化、非甲基化的引物，设计f.nucleatum引物，其中sfrp2的甲基化、非甲基化的引物序列如表1，

7、表1.sfrp2甲基化、非甲基化引物

8、

9、

10、septin9的甲基化和非甲基化引物序列如表2，

11、表2.septin9甲基化、非甲基化引物

12、

13、

14、f.nucleatum引物序列如表3，

15、表3.f.nucleatum引物

16、

17、s4、探针设计与筛选，其中sfrp2甲基化引物探针：5'ttgtgtgttagagttcgtgatgttttcgagtattgagttatgttatt3'；

18、septin9甲基化引物探针：

19、5'gaggggaagaggaggaggatttttcggggttgttagtgatattttt3'；

20、f.nucleatum引物探针：

21、5'aatggaagctacaagagaagaaaatgaaaatggtataagttataaag3'；

22、s5、微流控芯片设计，芯片包括通过孔径0.2cm的管道连通的加样区、era扩增区、crispr-cas12a反应区、侧向流结果判读区，其中crispr-cas12a检测区包被有相应的荧光探针；

23、s6、核酸扩增：era扩增区分别将筛选后的甲基化sfrp2、septin9特异性引物与甲基化处理后的核酸，以及具核梭杆菌特异引物与其核酸，利用era酶在等温条件下进行快速扩增反应；

24、s7、侧向流试纸条：采用了fam(fitc)-生物素报告基因进行免疫层析检测，阳性样品中，金粒抗生物素抗体与高浓度fam(fitc)-生物素报告基因充分结合，结合物在检测条带(t线)被抗fam(fitc)抗体拦截，形成显色条带；阴性样本，无完整的fam(fitc)-生物素报告基因，金粒抗生物素抗体形成不能被检测条带(t线)拦截，无显示条带。

25、2、根据权利要求1所述的一种基于酶促重组等温扩增检测粪便sfrp2、septin9dna甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，其特征在于：步骤s1中采用居家便携式核酸提取装置，该装置包括自热管(1)、核酸提取管(2)、磁珠预装模块(3)、搅拌件(4)、裂解液预装模块(5)、密封盖(6)、采样棒(7)、磁棒(8)。

26、本发明的有益效果包括：大大缩短了检测时间，简化了操作步骤，降低了对专业设备和操作人员的依赖，还提高了检测的灵敏度(可达10copies/μl)和特异性。

技术特征：

1.一种基于酶促重组等温扩增检测粪便sfrp2、septin9 dna甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，其特征在于：包括以下步骤，

2.根据权利要求1所述的一种基于酶促重组等温扩增检测粪便sfrp2、septin9 dna甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，其特征在于：步骤s1中采用居家便携式核酸提取装置，该装置包括自热管(1)、核酸提取管(2)、磁珠预装模块(3)、搅拌件(4)、裂解液预装模块(5)、密封盖(6)、采样棒(7)、磁棒(8)。

技术总结本发明公开了一种基于酶促重组等温扩增检测粪便SFRP2、SEPTIN9DNA甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，核心在于将ERA‑Cas12a技术结合微流控芯片技术应用于粪便样本SFRP2、SEPTIN9甲基化与具核梭杆菌。ERA‑Cas12a是一种新型的核酸酶，具有高度的特异性和灵敏性，能够在等温条件下实现核酸的快速扩增和检测。通过巧妙地设计特异性引物，本发明使得这些引物能够同时符合甲基化和ERA‑Cas12a技术的要求，从而确保了检测的高效性和准确性。利用微流控技术进行粪便SFRP2、SEPTIN9甲基化与具核梭杆菌核酸，简化了甲基化处理流程，并且让检测结果判读直观简单。技术研发人员：唐彬,曾颜,江雨航受保护的技术使用者：重庆市江津区中心医院技术研发日：技术公布日：2024/10/17