一种光启动核酸扩增的引物设计方法及应用

本发明属于生物分子，涉及的技术有聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，pcr)和扩增阻滞突变系统pcr(amplification refractory mutationsystem pcr，arms-pcr)，通过设计光控引物实现光启动核酸扩增检测，属于生物分子。

背景技术：

1、疟疾(malaria)是一种通过雌性按蚊叮咬传播给人类的疾病，可危及生命。疟疾分为恶性疟原虫(p.falciparum)，间日疟原虫(p.vivax)，三日疟原虫(p.malariae)，卵形疟原虫(p.ovale)和诺氏疟原虫(p.knowlesi)，其中恶性疟原虫是最致命的疟疾寄生虫，若不及时治疗，恶性疟原虫疟疾可在24小时内发展成严重疾病，甚至死亡。根据最新《世界疟疾报告》，在2022年一整年中，共发生2.49亿例疟疾病例，死亡人数估计为608000人。疟疾的早期检测能够做到早发现，早治疗，早控制，对于疟疾的防治有着重大意义。

2、目前疟疾的常用检测方法病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子学生物学诊断方法。这些方法均有各自的优缺点。厚薄血涂片是确诊疟疾的金标准，也是唯一可查到原虫实体并鉴别虫种的方法，但其操作繁琐，且需要自己取血涂片送至医院进行检查，不利于疟疾的快速检测治疗。血清学诊断方法是基于某些疟原虫特异性抗原或酶来进行检测，这两种方法灵敏度较低，无法检测低寄生虫血症的疟疾患者。而聚合酶链反应(pcr)以其高度的灵敏度和特异性成为了疟原虫检测的一大方法，对于低寄生虫血症的疟疾患者也能准确检出，大大缩短检测时间，及时治疗确诊患者。

3、由于非特异性扩增对于结果准确度影响较大，热启动pcr技术从而被发明来降低酶活性，直到高温启动后聚合酶恢复活性。而目前的热启动pcr技术是使用小分子、特异性抗体或核酸适配体来封闭耐高温聚合酶的活性，在高温条件下，其能解离释放聚合酶，使其恢复正常的聚合活性。但是这种热启动技术需要从文库中去筛选，使得这种技术的开发成本较高，复杂耗时，只适用于有90℃以上的扩增方法。而光控启动则是一种高效的控制方式，不需要高温，只需要简单的光照，就可以在几十秒内恢复聚合酶的活性，适用于所有聚合酶，在核酸扩增领域有着更广的应用范围。目前大多数光控启动扩增的方式是对酶进行修饰，但聚合酶是核酸扩增的关键，对聚合酶进行修饰改造有可能会对酶的活性产生影响。此外，针对于不同的聚合酶则需要开发不同的修饰改造方式，因此不是一种通用的控制方法。然而，使用化学修饰的引物去封闭聚合酶活性，则对酶没有任何结构上的影响，最大程度保留了酶的完整性。而引物是绝大多数核酸扩增所必需的，化学修饰对于引物是通用的，这种方式不仅成本较低，耗时较短，还可以适用于任何基于引物的核酸扩增方法，具有广阔的应用前景。

4、该项目建立了一个简单、快速的光启动核酸扩增方法实现了对pcr的光启动扩增，为疟疾的快速检测提供了新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种光启动核酸扩增的引物设计方法，将其与pcr方法联合起来，发明了一种新的核酸检测方法，命名为光启动pcr。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、首先通过ncbi查找靶标的保守序列，从而设计出在富含胸腺嘧啶的正常引物，根据arms-pcr在引物的胸腺嘧啶设计错配碱基(腺嘌呤)，再通过错配对于聚合酶聚合活性的抑制筛选出最低错配个数的引物，在错配的胸腺嘧啶位点进行化学基团修饰。当没有光照时，修饰过的光控引物完全抑制聚合酶延伸反应，而存在光照时，化学基团解离恢复成正常引物，可以进行延伸扩增。

4、作为优选地，该方法具体包括如下步骤：

5、(1)质粒的培养与提取

6、在lb培养基中培养top10细胞使其复制大量的携带恶性疟原虫保守序列的质粒(puc57)。用试剂盒tianpure midi plasmid kit提取质粒，提取的质粒作为后续扩增的模板。

7、(2)错配引物的设计

8、根据恶性疟原虫emp1保守基因选取79-1941bp的序列设计引物，长度1-60bp，使得反向引物具有1-60个胸腺嘧啶。再根据amrs-pcr对胸腺嘧啶位点设计错配，作为错配引物。

9、(3)重组酶聚合酶扩增(rpa)

10、根据rpa反应的说明书加入正常的正向引物和错配的反向错配引物、rpa反应液、模板、醋酸镁，然后将反应管放在abiq3荧光仪中，1-60℃反应1-180min，实时记录荧光。根据最低的荧光强度组，筛选出完全抑制聚合酶扩增的错配引物。

11、(4)光启动引物的设计

12、根据上述实验筛选的能够完全抑制聚合酶扩增的错配引物，在错配引物相应错配位点的胸腺嘧啶上修饰光敏基团，作为光启动引物。

13、(5)光启动聚合酶链式反应

14、根据pcr的说明书，在反应馆中加入pcr反应混合液、正常的正向引物、反向光启动引物、模板，混匀后进行光照。然后将反应液放入abiq3荧光仪中，pcr的反应条件为95℃，30s；95℃，5s，50-70℃，30s，35个循环，在延伸阶段记录荧光。

15、作为优选地，步骤(2)中，反向引物含有1-60个胸腺嘧啶(t)。

16、作为优选地，步骤(2)中，反向错配引物根据amrs-pcr将正常反向引物的胸腺嘧啶替换成其他碱基，与模板形成错配。

17、作为优选地，步骤(3)中，rpa扩增条件为1-100℃，反应1-180min。

18、作为优选地，步骤(4)中，引物在错配的碱基位点引入光敏分子(如香豆素、邻硝基苄基等)修饰的胸腺嘧啶。

19、作为优选地，步骤(5)中，光源功率采用1-200w，光照时间是采用光进行照射0-20min。

20、作为优选地，步骤(5)中，步骤(5)中，引物的浓度为200nm，pcr的反应条件为95℃，30s；95℃，5s，60-65℃，30s，35个循环。

21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

22、1.本发明提供了一种光控聚合酶聚合活性的光控引物设计方法，能够在时空上进行聚合酶聚合活性的调控；

23、2.本发明的通用性强、普及性高，不仅适用于pcr，且适用于其他所有以聚合酶和引物为基础的核酸扩增方法。

技术特征：

1.一种光启动核酸扩增的引物，其特征包括在核酸扩增中使用光控引物，该引物使用化学基团进行修饰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，反向引物含有1-60个胸腺嘧啶(t)。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，反向错配引物根据amrs-pcr将正常反向引物的胸腺嘧啶替换成其他碱基，与模板形成错配。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，rpa扩增条件为1-100℃，反应1-180min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，引物在错配的碱基位点引入光敏分子(如香豆素、邻硝基苄基等)修饰的胸腺嘧啶。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，光源功率采用1-200w，光照时间是采用光进行照射0-20min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，引物的浓度为200nm，pcr的反应条件为95℃，30s；95℃，5s，60-65℃，30s，35个循环。

技术总结本发明公开了一种使用光启动核酸扩增的引物设计方法，属于生物分子技术领域。光控引物设计包括如下步骤：根据保守序列设计胸腺碱基含量多的引物；并使用AMRS‑PCR对引物的胸腺碱基设计不同的错配；根据错配位置对引物进行化学基团修饰，建立光控核酸扩增体系，特异性好，检测速度快，可以使用光控制核酸扩增，通用性高、应用前景大。技术研发人员：于超,秦瑜繁,卿敏,刘小琼,陈欣受保护的技术使用者：重庆医科大学技术研发日：技术公布日：2024/10/10