一种短链脱氢酶突变体及其合成替格瑞洛关键手性中间体中的应用

本发明涉及生物，具体涉及一种短链脱氢酶突变体及其在不对称合成替格瑞洛关键手性中间体((s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ))中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、替格瑞洛是由阿斯利康公司(astrazeneca)开发的一款新型血小板聚集抑制剂，能够可逆地与p2y12adp受体相互作用，从而阻断adp诱导的血小板聚集，具有快速起效和抵消作用，被用于治疗或预防acs(不稳定性心绞痛、非st段抬高心肌梗死或st段抬高心肌梗死)及其他血小板聚集相关疾病，其结构如下：

2、

3、(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)是替格瑞洛合成过程中的重要手性中间体，其传统化学方法利用价格昂贵的三甲氧基硼烷和硼烷二甲硫醚共同作为手性还原剂，不仅十分危险而且容易造成环境污染(cn 107892693 a、cn 108083997a、cn 107641072a、cn 104974017a、w02008018822、w02008018823)。与化学路线相比，利用酮还原酶催化前体酮不对称合成化合物(ⅱ)具有反应条件温和、立体选择性好以及环境友好等特点。目前已有许多来源的酮还原酶被用来不对称合成化合物(ⅱ)，如leifsonia sp.strain s749(org.process res.dev.,2017,21(10):1595-1601),levilactobacillus suantsaii(biotechnol.bioeng.,2024.),lactobacillus kefiri(chem.-eur.j.2023,29(25):e202203530.)等。尽管部分酮还原酶催化活性良好，但它们大多为nadph依赖通过还原酶，而辅酶nadph较nadh价格昂贵，因此，为了进一步降低生产成本，提供一种新的酶法合成路线。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种短链脱氢酶突变体及其在不对称合成替格瑞洛关键手性中间体((s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ))中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为

3、一种短链脱氢酶突变体，短链脱氢酶sssdr1为seq id no.1所示氨基酸序列或至少与seq id no.1所示氨基酸序列80％同源一致性的氨基酸序列中至少一个位点突变所得；其中，位点为94，144，145，153，188，205中一个或多个。

4、所述突变体中94，144，145，153，188，205位点可相同或不同的对应突变为a、v、l、i。

5、所述突变体为短链脱氢酶sssdr1中94位点，144位点，145位点，153位点，188位点，205位点中1-4个位点进行突变。

6、所述第94位突变为a，第144位突变为a，第145位突变为a或l，第153位突变为l或i，第188位突变为a，第205位突变为a。

7、上述短链脱氢酶sssdr1来源于鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium siyangensesy1)。

8、一种dna分子，编码所述的短链脱氢酶突变体。

9、一种重组质粒，含有所述的dna分子。

10、一种所述的应用，所述突变体、所述dna分子、所述重组质粒在合成替格瑞洛关键手性中间体中的应用。

11、一种合成替格瑞洛关键手性中间体的催化剂，催化剂为所述突变体、所述dna分子或所述重组质粒。

12、所述生物催化剂为细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶的形式。

13、进一步的说，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(ⅰ)作为底物，不对称合成(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)，反应式为：

14、

15、一种合成替格瑞洛关键手性中间体的方法，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(ⅰ)作为底物，在所述突变体、所述dna分子或所述重组质粒存在下不对称合成(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)；反应体系中底物浓度为0.1-1200g/l，催化剂添加量为10-200g/l。

16、反应的合成路线为：

17、

18、进一步地，采用短链脱氢酶突变体对化合物(ⅰ)进行不对称还原生产手性化合物(ⅱ)的反应体系中还包括辅因子、辅因子再生体系、助溶剂和缓冲液。

19、所述辅因子为nad(p)+、葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶中的一种几种；优选为nad(p)+。

20、辅因子再生体系为异丙醇、葡萄糖、甲酸根化合物中的一种几种；优选为异丙醇。

21、助溶剂选自异丙醇、甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲苯中的一种或几种。

22、反应体系中底物浓度为0.1-1200g/l，考虑到反应效果，底物浓度优选0.1-1000g/l。

23、反应体系的ph值优选能够保持在短链脱氢酶可以表达其活性的ph范围内，反应体系的ph值为7.0-9.0。

24、反应体系温度优选能够保持在短链脱氢酶可以表达其活性的温度范围内，反应体系的温度为25-45℃。

25、辅因子其在反应体系中的终浓度为0-0.5mm，优选0.05-0.2mm。

26、辅因子再生体系其在反应体系中的终浓度为0-0.5mm，优选0.05-0.2mm。

27、在使用酶溶液的实施方案中，用于产生酶溶液的细胞可以是表达仅含有辅因子再生系统或含有辅因子再生系统和短链脱氢酶的酶。在使用全细胞的实施方案中，该细胞可以同时表达含有辅因子再生系统和短链脱氢酶的酶。

28、所述助溶剂浓度为反应体系的0.1-90％。

29、所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，缓冲液浓度为0.05-0.2m。

30、本发明的有益技术成果：

31、本发明对来源于鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium siyangense sy1)的短链脱氢酶基因sssdr1进行突变，在seq id no.1的野生型短链脱氢酶的基础上，利用定点突变的分子生物学方法对其进行突变，得到的短链脱氢酶突变体对合成替格瑞洛重要前体酮化合物(ⅰ)的催化活性显著提高，通过搭载nadh再生还原系统，能够实现替格瑞洛关键手性中间体(ⅱ)的高效不对称合成，立体选择性严格(ee>99.9％)，具有良好的工业应用潜力。

技术特征：

1.一种短链脱氢酶突变体，其特征在于：短链脱氢酶sssdr1为seq id no.1所示氨基酸序列或至少与seq id no.1所示氨基酸序列80％同源一致性的氨基酸序列中至少一个位点突变所得；其中，位点为94，144，145，153，188，205中一个或多个。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：所述突变体中94，144，145，153，188，205位点可相同或不同的对应突变为a、v、l、i。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：所述突变体为短链脱氢酶sssdr1中94位点，144位点，145位点，153位点，188位点，205位点中1-4个位点进行突变。

4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于：所述第94位突变为a，第144位突变为a，第145位突变为a或l，第153位突变为l或i，第188位突变为a，第205位突变为a。

5.一种dna分子，其特征在于，编码权利要求1所述的短链脱氢酶突变体。

6.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求5所述的dna分子。

7.一种权利要求1、5或6所述的应用，其特征在于：权利要求1所述突变体、权利要求5所述dna分子、权利要求6所述重组质粒在合成替格瑞洛关键手性中间体中的应用。

8.一种合成替格瑞洛关键手性中间体的催化剂，其特征在于：催化剂为权利要求1所述突变体、权利要求5所述dna分子或权利要求6所述重组质粒。

9.根据权利要求8所述的催化剂，其特征在于：所述生物催化剂为细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶的形式。

10.一种合成替格瑞洛关键手性中间体的方法，其特征在于：以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(ⅰ)作为底物，在权利要求1所述突变体、权利要求5所述dna分子或权利要求6所述重组质粒存在下不对称合成(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)；反应体系中底物浓度为0.1-1200g/l，催化剂添加量为10-200g/l。

技术总结本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种短链脱氢酶突变体及其在不对称合成替格瑞洛关键手性中间体((S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇(Ⅱ))中的应用。短链脱氢酶SsSDR1为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或至少与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列80％同源一致性的氨基酸序列中至少一个位点突变所得；其中，位点为94，144，145，153，188，205中一个或多个。本发明获得的酮还原酶突变体对底物(Ⅰ)具有更高的催化活性以及严格的立体选择性。本发明涉及的相关突变体具有催化活性高，立体选择性严格，反应条件温和等优势，对于替格瑞洛关键手性中间体(Ⅱ)的酶法不对称合成具有应用价值。技术研发人员：游松,车昌丽,贾娴,许欣,郑芷然受保护的技术使用者：沈阳药科大学技术研发日：技术公布日：2024/10/10