一种Kitlg基因敲除小鼠模型的构建方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种kitlg基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术：

1、耳聋，是最常见的感官缺陷疾病之一，严重影响患者的交流和认知能力，给个人、家庭和社会造成巨大的负担。耳聋的发生与环境因素和遗传因素相关，其中60％以上的感音神经性聋是由遗传因素导致的。随着测序技术的发展，越来越多的耳聋相关基因被发现，至今发现的与人类耳聋相关的基因已经超过150个。耳聋基因的发现及其致聋机制的研究，对耳聋的精准诊疗具有重要的指导意义。

2、2015年，zazo seco c等首次发现kitlg基因突变与非综合征型耳聋相关，随着研究的不断深入，人们发现该基因突变还与综合征型耳聋waardenburg综合征(听力-色素异常综合征)及家族性进行性色素沉着等疾病相关，但其具体致病机制还不清楚。kitlg又名干细胞生长因子(scf)，位于人类染色体12q21.32，编码酪氨酸激酶受体c-kit的配体。该配体与c-kit的胞外结构域结合，在膜上形成二聚体磷酸化胞内段酪氨酸残基，激活c-kit的酪氨酸蛋白激酶活性，使尾部的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化导致受体细胞内结构域的尾部装配成一个信号复合物，成为细胞内信号蛋白的结合位点，使不同的细胞内信号蛋白被激活，进一步启动下游的信号转导，包括pi3k信号途径、ras/erk信号途径、jak/stat信号途径等，进一步调控细胞的生理生化功能。kitlg基因编码的蛋白是一种多效因子，在子宫生殖细胞产生、神经细胞的发育、造血功能及黑色素的形成中发挥着重要的作用。构建kitlg基因编辑小鼠，模拟人类相关疾病表型，为研究其致病机制提供重要的模型，并为疾病防治提供理论基础。

3、crispr/cas9技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过导向rna(sgrna)介导核酸内切酶cas9蛋白进行目标dna序列识别并造成dna双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损dna，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入等。与锌指核酸酶技术和类转录样效应因子核酸酶技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。

技术实现思路

1、针对现有技术，本发明提供一种kitlg基因敲除小鼠模型的构建方法。本发明利用crispr/cas9技术构建kitlg基因敲除小鼠，本发明所用的打靶质粒px330包含sgrna及cas9序列，不需要转录mrna，而是直接将连接有目标靶序列的质粒显微注射到小鼠受精卵，操作过程更加简便。将为研究kitlg基因突变导致耳聋及色素异常等疾病的致病机制提供重要模型。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种kitlg基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

4、(1)设计合成靶向小鼠kitlg基因的特异性靶点序列：

5、在kitlg基因的2号外显子区域寻找相应的靶点序列tcaaaaccaaggagatctgc，如seq no.5所示。

6、(2)利用限制性内切酶bbsi酶切质粒px330(addgene，plasmid#42230)：

7、利用bbsi酶切质粒px330，并进行1％的琼脂糖凝胶电泳，割胶回收酶切产物。

8、(3)连接靶序列引物至px330酶切产物：

9、将合成的靶点序列引物进行退火，连接退火产物与px330酶切产物，具体过程如下：

10、1)将合成的靶点序列引物加水稀释为10μm，分别取10μl seq no.1和10μl seqno.2混合，混匀后放入pcr仪运行条件，95℃5min，每30s一个循环，每个循环降1度，降至4℃保存。利用t4 dna连接酶连接退火产物与px330酶切产物16℃连接过夜。连接体系如下：

11、

12、(4)转化及测序验证：

13、将连接产物转化至感受态dh5α，挑选单克隆，测序验证得到正确的质粒，具体过程如下：

14、将连接产物转化至dh5α感受态细胞，涂到含氨苄青霉素的lb平板37℃培养箱培养16-18h，挑单克隆至1ml含氨苄青霉素的lb液体培养基中，通过sanger测序筛选连接成功的质粒，测序引物为通用引物m13，序列如下所示：

15、m13:5’-cagggttttcccagtcacgac-3’。

16、(5)将连接正确的质粒显微注射入小鼠受精卵的原核中：

17、将sanger测序验证序列连接成功的菌液扩大培养后，提取质粒并纯化，冻存于rnaase free的超纯水中，px330重组质粒的混合物注射到小鼠受精卵的原核中，体外培养后植入到假孕的雌鼠体内。

18、(6)f0代小鼠出生与鉴定：

19、剪小鼠趾甲并提取dna，以dna为模板进行pcr扩增并将产物测序，所用引物如seqno.3和seq no.4所示。

20、(7)f0代小鼠性成熟配繁，获得f1代小鼠，f1代小鼠自交获得f2代小鼠：

21、f0代小鼠性成熟后与野生型异性小鼠交配获得f1代小鼠，鉴定f1代小鼠的基因型并自交获得f2代杂合子或纯合子小鼠。

22、(8)基因敲除小鼠基因型鉴定及表型分析

23、鉴定小鼠的基因型，分析kitlg基因敲除小鼠的外观表型及听力情况等，鉴定方法如步骤(6)所述。

24、本发明构建的kitlg基因敲除小鼠，部分小鼠会出现听力异常，主要表现为单侧聋或双耳非对称性聋。约90％的kitlg基因敲除小鼠的毛发会出现异常，主要表现为头顶白毛及腹部白毛等。根据文献报道，kitlg基因突变导致的疾病的表型主要为耳聋(单侧聋或双耳非对称性聋)额间白发及皮肤白斑等，表明该小鼠模型在表型上与携带kitlg基因突变的病人的临床表现一致。小鼠的基因型包括杂合子及野生型，纯合子小鼠无法存活。

25、目前，国内外文献报道、专利数据库等未见相关kitlg基因敲除小鼠模型的信息。

26、本发明的有益效果：本发明利用crispr/cas9技术，构建了国际上首个kitlg基因敲除小鼠模型。本发明的重点在于，精确找到kitlg基因敲除的靶点序列，并针对其设计了合适的sgrna，将重构的px330质粒注射到小鼠受精卵的核内，构建过程更加简便。kitlg基因敲除模型小鼠的表型与携带kitlg基因突变的病人的临床表现一致，可进一步广泛用于kitlg致病机制及基因治疗等研究当中。

技术特征：

1.一种用于构建kitlg基因敲除小鼠模型的靶序列引物，其特征在于，其序列包含kitlg基因的2号外显子区域相应的靶点序列tcaaaaccaaggagatctgc及其互补序列。

2.根据权利要求1所述的一种用于构建kitlg基因敲除小鼠模型的靶序列引物，其特征在于，其序列如seq no.1和seq no.2所示。

3.一种用于鉴定kitlg基因敲除小鼠模型的引物，其特征在于，其序列如seqno.3和seqno.4所示。

4.一种构建kitlg基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种构建kitlg基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

6.根据权利要求4所述的一种构建kitlg基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述靶向小鼠kitlg基因的特异性靶点序列，如seq no.5所示。

7.根据权利要求4所述的一种构建kitlg基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述的靶点序列引物，其序列如seq no.1和seq no.2所示。

8.根据权利要求4所述的一种构建kitlg基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，步骤(6)中鉴定基因敲除小鼠基因型的引物如seq no.3和seq no.4所示。

技术总结本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Kitlg基因敲除小鼠模型的构建方法。本发明利用CRISPR/Cas9技术构建Kitlg基因敲除小鼠，本发明所用的打靶质粒PX330包含sgRNA及Cas9序列，不需要转录mRNA，而是直接将连接有目标靶序列的质粒显微注射到小鼠受精卵，操作过程更加简便。将为研究KITLG基因突变导致耳聋及色素异常等疾病的致病机制提供重要模型。技术研发人员：徐磊,肖云,金钰,张爱珍,王海波受保护的技术使用者：山东省第二人民医院（山东省耳鼻喉医院、山东省耳鼻喉研究所）技术研发日：技术公布日：2024/10/10