一种3D生物打印制备的肝小叶模型及其构建方法和应用与流程

本发明涉及医用生物材料，具体涉及一种3d生物打印制备的肝小叶模型及其构建方法和应用。

背景技术：

1、肝脏是人体最大的消化器官，也是维持体内稳态最重要的器官，具有代谢、分泌、排泄、生物转化等1500多种功能。通常情况下，肝脏在受到一定的物理与化学损伤后具有可再生修复的能力，但是过度或持续的损伤会打破肝脏组织损伤与修复之间的平衡，使肝脏发生不可逆病变，导致肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌甚至因肝衰竭而死亡。肝病是全世界疾病和死亡的主要原因。肝脏疾病病因多样，发病过程复杂，目前大都缺乏有效的治疗手段。体外仿生构建肝脏模型不仅有助于肝脏生理和病理机制的理解，也为新药开发和临床前药物毒性评测提供重要工具，其功能的有效建立更有望为肝移植患者提供细胞替代治疗，具有重要的研究价值。

2、肝脏功能的实现依赖于肝细胞和肝脏微环境的相互作用，因此体外肝脏模型的构建主要通过对肝脏微环境的体外仿生来实现，模拟体内相似的微环境，从而维持细胞长期的稳定性和功能。肝脏微环境在肝小叶中呈不均一的梯度分布，此现象被称为肝脏分区。血液由位于周围的汇管区流向中心的中央静脉区，按血流方向肝小叶被分为三个功能区，即汇管区(zone 1,portal vein，pv区)、中间过渡区(zone 2)和中央静脉区(zone 3,centralvein，cv区)。组成肝小叶的肝细胞板在营养、氧含量、激素和wnt信号分子等方面存在梯度，pv区氧含量高，营养物质丰富，肝细胞主要负责对能量要求较高的氧摄取、葡萄糖输送、糖异生、尿素合成、脂肪酸氧化、胆固醇合成和硫酸化，cv区氧含量低，代谢废物富集，主要负责对能量要求较低的葡萄糖摄取、糖酵解、氨基酸合成、胆汁酸产生、脂质合成和细胞色素p450(cyp450)的代谢，中间过渡区主要负责铁调节等。

3、与肝细胞一样，在肝小叶中，非实质细胞也具有分区分布的特点。cv区的肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，lsec)高表达wnt2、wnt9b、rspo3等与wnt信号通路相关的分子，而pv区的lsec高表达dll4、efnb2、ltbp4等与notch信号通路相关的分子。

4、3d生物打印技术具有以精确方式对细胞和生物材料进行图案化的优势，为实现结构复杂性不断增加的新型仿生体外肝脏模型提供了很好的工具。3d生物打印方法包括喷墨式生物打印、挤压式生物打印和光辅助式生物打印，通常利用具有良好的生物相容性、低免疫原性、低毒性和亲水性的海藻酸盐作为打印材料。

5、目前体外仿生构建肝小叶模型存在肝小叶功能分区重建困难，因此，亟需开发一种新的能够实现肝小叶功能分区的肝小叶模型的制备方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种生物打印制备肝小叶模型的方法，利用该方法打印出的肝小叶，能够分泌更高浓度的alb、产生尿素且具有较高的cyp3a4的活性，与实际肝脏中的肝小叶功能类似，并且本发明的肝小叶模型实现了pv区、过渡区和cv区分区，与实际肝小叶结构类似，实现了体外仿生肝小叶模型的构建。本发明方法构建的肝小叶可用于肝脏药物敏感性测试和肝脏疾病建模等应用性研究。

2、为此，本发明第一方面提供一种生物打印制备肝小叶模型的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：

3、(1)分别制备过表达wnt2基因的肝窦内皮细胞和过表达dll4基因的肝窦内皮细胞；

4、(2)将所述过表达wnt2基因的肝窦内皮细胞和过表达dll4基因的肝窦内皮细胞分别与肝实质细胞共培养，获得共培养混合细胞1和共培养混合细胞2；

5、(3)利用3d生物打印技术，分别对所述共培养混合细胞1、肝实质细胞以及所述共培养混合细胞2进行分区打印，以便获得具有pv区、过渡区以及cv区分区的肝小叶模型。

6、3d打印肝脏模型从单细胞到多细胞打印，从无形到仿生，从工艺到功能，从单一技术到技术联合得到了迅速的发展。目前肝小叶的3d打印模型主要有肝实质细胞和npc共培养的肝小叶状肝组织、多细胞和不同细胞外基质混合打印的具有肝小叶形状的肝组织以及具有血管化结构的肝小叶实际大小的肝组织，这些类肝小叶组织均显示出比单纯3d培养更高的白蛋白分泌、尿素产生等功能，以及白蛋白、mrp2和cd31蛋白水平的表达和细胞色素p450酶活性，但均缺乏肝小叶功能分区的重建。

7、肝小叶是肝脏的结构和功能单元，因此，构建肝小叶模型是体外肝脏模型构建的基础，仿生肝小叶微环境是构建体外肝小叶模型的前提。发明人的研究策略是，通过构建wnt2和dll4过表达的内皮细胞以分别代表cv区和pv区肝窦内皮细胞，将肝细胞与该两种内皮细胞以及过渡区的肝实质细胞，通过3d生物打印重现肝小叶的结构和建立cv区、过渡区以及pv区功能。本发明方法构建的肝小叶可用于肝脏药物敏感性测试和肝脏疾病建模等应用性研究。

8、根据本发明的实施方案，所述肝实质细胞包括选自heparg细胞、hepg2细胞、原代人肝细胞、人诱导多潜能干细胞中的至少之一。

9、根据本发明的实施方案，进行共培养时，所述肝实质细胞与所述过表达wnt2基因的肝窦内皮细胞的接种比例为(1.5-2.5)：1。

10、根据本发明的实施方案，进行共培养时，所述肝实质细胞与所述过表达dll4基因的肝窦内皮细胞的接种比例为(1.5-2.5)：1。

11、根据本发明的实施方案，共培养时的培养温度为37℃，培养时间为3-5天。

12、根据本发明的实施方案，步骤(3)进一步包括：

13、1)分别将所述共培养混合细胞1、肝实质细胞、共培养混合细胞2和生物材料混合，获得混悬液1、混悬液2和混悬液3；

14、2)利用所述混悬液3打印pv区肝细胞，并在中间区域留有待打印的过渡区以及cv区肝细胞的空隙；

15、3)利用所述混悬液2打印过渡区肝细胞，并在中间区域留有待打印的cv区肝细胞的空隙；

16、4)利用所述混悬液1打印cv区肝细胞，所述cv区肝细胞集中位于所述pv区以及所述过渡区肝细胞的内部，使得所述pv区肝细胞包围所述过渡区肝细胞，所述过渡区肝细胞包围所述cv区肝细胞，以便获得具有pv区、过渡区以及cv区分区的肝小叶模型。

17、根据本发明的实施方案，步骤1)进一步包括：

18、在分别将所述共培养混合细胞1、肝实质细胞、共培养混合细胞2和生物材料混合前，将细胞消化为单细胞。

19、根据本发明的实施方案，所述生物材料包括明胶和海藻酸钠。

20、根据本发明的实施方案，所述生物材料包括7.5％-15％的明胶溶液和3％-4.5％的海藻酸钠溶液。

21、根据本发明的实施方案，所述明胶溶液和海藻酸钠溶液的溶剂为去离子水。

22、根据本发明的实施方案，在分别进行共培养混合细胞、肝实质细胞和生物材料混合时，共培养混合细胞悬液或肝实质细胞悬液与所述明胶、海藻酸钠溶液的体积比为1：1：1。

23、根据本发明的实施方案，所述共培养混合细胞悬液中细胞浓度为5000–6000个/μl。

24、根据本发明的实施方案，所述肝实质细胞悬液中细胞浓度为5000–6000个/μl。

25、根据本发明的实施方案，步骤4)进一步包括：

26、利用2价阳离子交联剂，对打印出的cv区肝细胞、过渡区肝细胞和pv区肝细胞进行交联固定。

27、根据本发明的实施方案，所述2价阳离子包括ca2+、ba2+、cu2+、zn2+、sr2+中的至少之一。

28、根据本发明的实施方案，所述2价阳离子交联剂包括氯化钙、氯化钡、氯化铜、氯化锌、氯化锶、乳酸钙、乳酸钡、乳酸铜、乳酸锌以及乳酸锶中的至少之一。

29、根据本发明的实施方案，步骤3)中所述pv区肝细胞呈正六边形分布，所述正六边形宽度为0.5-100mm。

30、根据本发明的实施方案，所述过渡区肝细胞位于所述正六边形的中间区域，且所述过渡区肝细胞呈环形分布，宽度为1-200mm。

31、根据本发明的实施方案，所述cv区肝细胞位于所述正六边形中央区域，且所述cv区肝细胞呈圆点形分布，直径为0.25-50mm。

32、本发明第二方面提供一种肝小叶模型。根据本发明的实施方案，所述肝小叶模型通过第一方面所述的生物打印制备肝小叶模型的方法制备获得。

33、本发明第三方面提供一种生物打印制备肝脏模型的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：

34、利用第一方面所述的生物打印制备肝小叶模型的方法制备多个呈蜂窝状排布的肝小叶单元，以便获得肝脏模型。

35、体外仿生构建肝脏模型不仅有助于肝脏生理和病理机制的理解，也为新药开发和临床前药物毒性评测提供重要工具，其功能的有效建立更有望为肝移植患者提供细胞替代治疗，具有重要的研究价值。本发明提供了一种生物打印制备的具有特定形状结构功能肝小叶的方案，为肝功能探索及药物筛选提供模型。生物打印所用的生物墨水由明胶，海藻酸钠以及特定分区的特定细胞的悬液组成，最后由2价阳离子室温交联固定而成。

36、根据本发明的一个优选的实施方案，将cv区两种细胞(wnt2过表达内皮细胞与肝实质细胞混悬液)、肝实质细胞以及pv区两种细胞(dll4过表达内皮细胞与肝实质细胞混悬液)分别与明胶和海藻酸钠基的天然生物墨水混合后，按照预设路径进行肝小叶的3d打印。打印的模型cv区直径约0.3mm，过渡区宽约1.5mm，pv区宽约0.2mm，整体六边形(类肝小叶)最长径约2mm。打印成功后进行培养与功能的建立，能够为下一步进行肝细胞功能的表征和药物肝毒性的评价提供基础。

37、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。