一种细胞制剂支原体检测方法及其试剂盒与流程

本发明涉及细胞制剂检测领域，具体涉及一种细胞制剂支原体检测方法及其试剂盒。

背景技术：

1、细胞治疗领域的研究热点是干细胞和免疫细胞，均需遵照国家法律、法规与行政管理规定等，其细胞来源、生产工艺和临床应用过程均需在符合的前提下开展。支原体(mycoplasma)是细胞培养过程中常见的外源性污染物，开展支原体污染检测是细胞质量控制微生物学安全性评价体系中的一项重要内容。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种细胞制剂支原体检测方法及其试剂盒。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种细胞制剂支原体检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

3、(1)将定量待测细胞制剂样品与定量α-甘露糖苷酶、定量6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷于ph为3.5～4.5的缓冲溶液中在36～38℃孵育15～60分钟；

4、(2)孵育结束时向反应体系中加入定量苦马豆素抑制剂终止反应；

5、(3)检测步骤(2)处理后的液体在505～515nm处的吸光信号强度；

6、(4)在0～200cfu/ml的范围内配置5～8个不同浓度的支原体溶液，且包含空白溶液，将5～8个不同浓度的支原体溶液分别依次按照步骤(1)～(3)进行处理，获取支原体溶液浓度与吸光信号强度的映射关系；

7、(5)将待测细胞制剂样品的吸光信号强度代入步骤(4)获得的映射关系中，计算待测细胞制剂样品中的支原体浓度。

8、上述细胞制剂支原体检测方法中，支原体对α-甘露糖苷酶具有抑制作用，α-甘露糖苷酶将显色底物6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷水解反应后，在505～515nm处的吸光信号产生变化，通过构建支原体含量与吸光信号之间的映射关系，可以实现细胞制剂支原体含量检测。

9、优选地，所述步骤(1)中，将定量待测细胞制剂样品离心，收集上清液a同时收集沉淀细胞；将沉淀细胞加入定量ph为3.5～4.5的缓冲溶液悬浮机械破碎得到细胞破碎液b；将上清液a与细胞破碎液b分别进行步骤(1)～(3)的处理检测，获得上清液a的吸光信号强度a，细胞破碎液b的吸光信号强度b；吸光信号强度a、吸光信号强度b代入步骤(4)获得的映射关系中，得到上清液中a的支原体浓度a和细胞破碎液b中的支原体浓度b，支原体浓度a与支原体浓度b的比值记作环境影响系数α。

10、上述细胞制剂支原体检测方法中，通过将待测细胞制剂离心，收集上清液a同时收集沉淀细胞，并形成破碎细胞液，对上清液a、破碎细胞液进行步骤(1)～(3)的同步检测，可以实现对细胞外、细胞内支原体含量的检测，首次提出了同时对细胞制剂的细胞外和细胞内的支原体含量的检测，并且同时实现细胞制剂的细胞外和细胞内的支原体含量的检测，获得细胞外的支原体浓度a与细胞内的支原体浓度b，支原体浓度a与支原体浓度b的比值记作环境影响系数α，α越小表示细胞制剂中的细胞感染受细胞制剂的胞外环境影响越小。

11、优选地，所述步骤(1)中，待测细胞制剂样品、α-甘露糖苷酶、6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷、ph为3.5～4.5的缓冲溶液混合的孵育体系中，6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷的浓度为2.5～3.5mg/ml，α-甘露糖苷酶的浓度按照蛋白计量为10～15mg/ml。

12、上述细胞制剂支原体检测方法在上述参数条件下检测，方法具有更好的灵敏度，检出限更低。

13、优选地，ph为3.5～4.5的缓冲溶液为0.08～0.15mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，将步骤(2)反应后的溶液定容至0.8～1.5ml。

14、优选地，步骤(1)中孵育的时间为20～30分钟。

15、优选地，6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷的溶剂为含0.7％～0.8％tritonx-100的ph为3.5～4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

16、优选地，缓存溶液的ph为3.9～4.1。

17、优选地，所述检测方法包括以下步骤：

18、(1)取不超过150μl的定量待测细胞制剂样品离心，收集上清液a同时收集沉淀细胞，向上清液a中加入ph为3.9～4.1的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至150μl～200μl，将沉淀细胞加入ph为3.9～4.1的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液重悬破碎得到破碎细胞液b，定容后的上清液a的体积与破碎细胞液b的体积相等，将定容后150μl～200μl上清液a、50～100μl蛋白计量为100～300mg/ml的α-甘露糖苷酶、50～100μl25～70mg/ml的6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷于ph为3.9～4.1的0.08～0.15mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中在36.5～37.5℃孵育20～30分钟得到孵育液a；将150μl～200μl破碎细胞液b、50～100μl蛋白计量为100～300mg/ml的α-甘露糖苷酶、50～100μl25～70mg/ml的6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷于ph为3.9～4.1的0.08～0.15mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中在36.5～37.5℃孵育20～30分钟得到孵育液b；

19、(2)孵育结束时向反应体系中加入8～15μl100～500mg/ml苦马豆素抑制剂终止反应；

20、(3)分别将检测步骤(2)处理后的孵育液a、孵育液b定容至0.8～1.5ml，检测在510～513nm处的吸光信号强度；

21、(4)在0～200cfu/ml的范围内配置5～8个不同浓度的支原体溶液，且包含空白溶液，将5～8个不同浓度的支原体溶液分别依次按照步骤(1)～(3)进行处理，获取支原体溶液浓度与吸光信号强度的映射关系；

22、(5)获得定容后孵育液a的吸光信号强度a、定容后孵育液b的吸光信号强度b；吸光信号强度a、吸光信号强度b代入步骤(4)获得的映射关系中，得到上清液中a的支原体浓度a和细胞破碎液b中的支原体浓度b，支原体浓度a与支原体浓度b的比值记作环境影响系数α。

23、本发明还提供一种细胞制剂支原体检测试剂盒，检测试剂盒包含α-甘露糖苷酶、25～70mg/ml的6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷、ph为3.9～4.1的0.08～0.15mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、100～500mg/ml苦马豆素抑制剂。

24、优选地，所述检测试剂盒还包含说明书，所述说明书记载上述所述细胞制剂支原体检测方法中的至少一种。

25、优选地，α-甘露糖苷酶为蛋白计量为100～300mg/ml的α-甘露糖苷酶，α-甘露糖苷酶的溶剂为ph为3.9～4.1的0.08～0.15mol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。

26、优选地，6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷的溶剂为含0.7％～0.8％tritonx-100的ph为3.5～4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

27、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种细胞制剂支原体检测方法及其试剂盒，本发明细胞制剂支原体检测方法中，支原体对α-甘露糖苷酶具有抑制作用，α-甘露糖苷酶将显色底物6-氯-3-吲哚-a-d-甘露糖苷水解反应后，在505～515nm处的吸光信号产生变化，通过构建支原体含量与吸光信号之间的映射关系，可以实现细胞制剂支原体检测。本发明细胞制剂支原体检测方法可以实现对细胞外、细胞内支原体含量的检测，并且同时实现细胞制剂的细胞外和细胞内的支原体含量的检测，首次提出了同时对细胞制剂的细胞外和细胞内的支原体含量的检测，获得细胞外的支原体浓度a与细胞内的支原体浓度b，支原体浓度a与支原体浓度b的比值记作环境影响系数α，α越小表示细胞制剂中的细胞感染受细胞制剂的胞外环境影响越小。