羊抗F17大肠杆菌感染关键lncRNA及其应用

本发明属于分子生物学，具体涉及一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna及其应用。

背景技术：

1、羔羊腹泻是集约化养殖场最常见的疾病之一，其在世界各国长期存在，造成了巨大的经济损失。f17大肠杆菌是导致羔羊腹泻的主要致病菌之一，具有高检出率和高死亡率的特征。然而，有关绵羊抗f17大肠杆菌感染的免疫调控及抗病机制研究还不充分。目前，防治羔羊腹泻病的主要手段是土霉素、庆大霉素等抗生素药物，但兽药的过渡使用和滥用导致大肠杆菌的耐药性不断增强，同时大量的药品残留也会对动物和人类健康产生威胁，抗病育种成为了解决抗生素残留问题的更好方法。

2、lncrna作为一种非编码rna，可以通过转录、转录后以及表观遗传等途径发挥调控作用，参与家畜疫病调控，介导细菌免疫反应等过程。因此，本研究基于前期通过f17大肠杆菌攻毒区分出羔羊拮抗性和易感型个体的结果，开展全转录组测序，筛选差异表达lncrna，并在细胞水平验证其生物学功能，鉴定可作为羊抗f17大肠杆菌感染的关键lncrna作为标志物，为未来羊抗病育种提供基础。

技术实现思路

1、本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna与引物及其应用。

2、本发明的目的之一在于，提供羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna，所述lncrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。

3、本发明的目的之二在于，提供羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的筛选和功能验证方法。

4、本发明的目的之三在于，提供一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna作为标志物的引物及其应用。

5、本发明提供了一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的应用，所述loc105604616的rt-qrpcr引物用来检测羊小肠组织loc105604616表达水平，从而判断羊抗f17大肠杆菌感染能力的强弱。

6、为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

7、本发明提供一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的筛选方法，包括以下步骤：

8、（1）分析f17大肠杆菌拮抗组和易感组中差异表达lncrna；

9、（2）差异表达lncrna靶基因预测及通过go和kegg数据库进行生物功能富集分析；

10、（3）随机选取6个差异表达的lncrna，通过rt-qpcr检测在羊f17大肠杆菌易感组/拮抗组小肠组织表达水平，与测序结果比较，明确表达趋势是否一致；

11、（4）构建差异最显著的lncrna—loc105604616过表达载体，转染小肠细胞后，实验组和对照组接种相同量的f17大肠杆菌，2-3h后进行菌落计数和菌毛基因rt-qpcr检测，验证loc105604616对绵羊小肠上皮细胞抗f17大肠杆菌感染的影响。

12、具体地，本发明提供的羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的筛选方法，所述方法为全转录组测序，测序对象为羊小肠组织，测序平台为illumina测序平台，包括以下步骤：

13、（1）通过提取拮抗组和易感组小肠组织rna，rna质量鉴定合格后，建立cdna文库，再进行测序获取raw reads，过滤后得到clean reads；

14、（2）利用hisat2软件将clean reads和绵羊oar_v4.0参考基因组进行比对，比对成功的reads利用stringtie软件组装，组装后的转录本根据incrna的结构及非编码等功能特征进行分析，初步筛选条件如下：①长度≥200nt，外显子个数≥2的转录本；②筛除所有样本的reads覆盖度均<5的转录本；③利用cuffcompare同该物种的注释文件进行对比，筛除已知的mrna和其他非编码rna；④使用cuffcompare将剩余的lncrna分类；

15、（3）使用fpkm法（fragments per kb per million reads）标准化表达量，利用deseq软件分析f17大肠杆菌易感组和拮抗组之间lncrnas的差异表达情况，差异表达lncrna的默认条件为 p value≤0.05且| log2foldchange |≥1，共发现190个差异表达的lncrnas；

16、（4）差异表达lncrnas进行co-location（位置相关性）和co-expression（表达相关性）预测靶基因，使用kobas (ko-based annotation system)程序对差异表达lncrna的靶基因进行go（gene ontology）和kegg（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，筛选出差异大且与细菌免疫相关的lncrnas作为候选lncrnas；

17、（5）随机选取6个差异表达较大的lncrnas，通过rt-qpcr在羊f17大肠杆菌易感组/拮抗组小肠组织检测表达水平，并与测序结果比对，发现表达趋势一致，测序结果准确。

18、本发明提供一种羊抗f17大肠杆菌感染的标志物，所述标志物为差异最显著的lncrna—loc105604616，其序列如seq id no:1所示。

19、本发明提供了一种羊抗f17大肠杆菌感染标志物的引物，所述标志物的引物，其序列如seq id no:2和3所示。

20、本发明提供了上述标志物引物在检测羊抗f17大肠杆菌感染能力中的应用，包括以下步骤：

21、（1）以羊小肠组织rna为模板，反转录成cdna，以seq id no:2序列引物进行荧光定量pcr扩增；

22、（2）采用2^- △△ct 法计算定量结果，根据loc105604616表达水平，确定羊抗f17大肠杆菌感染能力的强弱。

23、本发明的优点是通过羊小肠细胞的全转录组测序筛选了羊抗f17大肠杆菌感染的差异lncrna，结合rt-qpcr技术检测候选lncrna在f17大肠杆菌拮抗/易感组羊小肠组织和f17大肠杆菌感染/对照组绵羊小肠上皮细胞中的表达差异水平，选择出了差异最显著的loc105604616作为候选lncrna，并通过细胞实验验证发现loc105604616能够提高绵羊小肠上皮细胞抗f17大肠杆菌感染的能力，说明loc105604616表达量的羊个体对f17大肠杆菌感染的抵抗能力更强。因此，本发明设计loc105604616的特异性引物，随机采集羊群中个体小肠组织，进行rt-qpcr检测，根据表达量高低确定羊群对f17大肠杆菌感染的抵抗能力强弱，这为未来羊的抗病育种提供了很好的基础。

技术特征：

1.一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna，其特征在于，所述lncrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.如权利要求1所述羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的引物，其特征在于，所述loc105604616的rt-qpcr引物如seq id no:2和3所示。

4.如权利要求3所述的一种羊抗f17大肠杆菌感染关键lncrna的应用，其特征在于，所述loc105604616的rt-qpcr引物用来检测羊小肠组织loc105604616表达水平，从而判断羊抗f17大肠杆菌感染能力的强弱。

技术总结本发明公开了一种羊抗F17大肠杆菌感染关键lncRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过测序得到小肠组织差异lncRNA，通过功能富集对差异lncRNA进一步筛选，利用RT‑qPCR随机检测差异表达lncRNA验证测序结果准确性，在小肠细胞中过表达差异最显著的LOC105604616检测其在F17大肠杆菌感染/非感染组中表达水平，验证发现其能够提高绵羊小肠上皮细胞抗F17大肠杆菌感染的能力，进而发现LOC105604616可以作为标志物，从而可以判断羊抗F17大肠杆菌感染的能力。技术研发人员：吕晓阳,孙伟,任梓铭,陈炜昊,苏锐,王叶青,丁建平,成志军,高辉受保护的技术使用者：扬州大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18