一种基于mCherry的筛选系统及其构建方法与应用

本发明涉及生物，特别涉及一种基于mcherry的筛选系统及其构建方法与应用。

背景技术：

1、近年来，研究人员倾向于利用酵母等简单生物模型来加快对未知基因功能的探索，为人类细胞基因研究提供重要线索和参考。

2、裂殖酵母作为模式生物具有遗传工具丰富、保守的细胞结构和生理机制、快速生长、大量可用的基因组数据以及可适应不同环境条件等优点，但除了杂交外，裂殖酵母还能够与自身交配。因此，在研究两个不同背景的裂殖酵母杂交时，要将自身交配的细胞与杂交的细胞区分开。裂殖酵母杂交体的筛选通常采用常见的细胞杂交体的筛选方法，包括：营养缺陷筛选法、药物抗性标记筛选法、表型标记筛选法、基因组标记筛选法等，但这些方法都有各自的局限性。

3、营养缺陷筛选法的原理是：选择两个分别具有不同营养缺陷的单倍体细胞，这些缺陷可以是对特定营养物质的需求或对特定毒性化合物的敏感性；将这两个单倍体细胞进行杂交，形成杂交子代；随后，设计培养基，使得只有合并了两个单倍体亲本的染色体组合的二倍体细胞能够在其中生长；将杂交子代接种到筛选培养基中培养，观察并筛选出能够生长的克隆；这些克隆即为所需的杂交体。其缺点在于：筛选过程中需要进行长时间的培养和观察，可能需要耗费较长的实验周期；并且，某些营养缺失条件可能影响细胞内其他代谢途径或产生非特异性反应，导致结果不确定性，在一定程度上对细胞正常的生命活动造成损伤；同时，筛选过程中可能会出现假阳性或假阴性结果，需要进行确认和排除。

4、表型标记筛选法的原理是：选择两个单倍体细胞，它们分别具有不同的可观察表型特征，比如形态特征、生长速率、色素沉淀等，将这两个单倍体细胞进行杂交，形成杂交子代；然后，通过观察杂交子代的表型特征，根据所需寻找具有两个亲本表型特征的结合或表现的杂交体，筛选出合适的杂交体。其缺点在于：可能存在表型的多态性，导致筛选结果不确定性较大；并且，一些表型特征可能受到多基因控制，难以准确判断杂交体的基因组组合；对于一些需要定量分析的表型特征，如生长速率等，可能需要进一步的测量和分析。

5、基因组标记筛选法的原理是：选择两个具有所需基因组组合的单倍体细胞，利用分子生物学技术，在这两个单倍体细胞中对特定基因或dna序列进行标记；标记可以是利用pcr、southern blotting、dna测序等技术进行的，将这两个带有不同标记的单倍体细胞进行杂交，形成杂交子代，利用相应的分子生物学技术，如pcr、southern blotting等，检测杂交子代中的基因组标记，通过检测标记来确定含有所需基因组组合的杂交体。其缺点在于：对技术要求高，需要熟练掌握分子生物学技术，如pcr、southern blotting等，操作相对复杂；同时，与其他筛选方法相比，基因组标记筛选法可能需要更多的实验材料和试剂，成本较高；最重要的一点是基因组标记筛选法依赖于对目标基因组的了解和已知标记技术的可用性，对于未知基因或未知标记位点的筛选可能不适用。

6、药物抗性标记筛选法的原理是：选择两个单倍体细胞，通过基因工程技术，在细胞的基因组中分别引入对不同药物具有抗性的基因，使其在培养基中对特定药物具有耐受性；将这两个带有不同药物抗性标记的细胞进行杂交，形成杂交子代；然后，将杂交子代接种到含有相应药物的培养基中培养，只有含有对应药物抗性基因的杂交体能够在药物存在的环境中存活和生长，其他细胞则被选择性地杀死。其缺点在于：受限于可用的药物抗性基因，需要有对目标药物具有抗性的合适的基因可用，限制了筛选方法的选择性；同时还依赖于药物的选择性毒性，某些药物可能对细胞的生长有不同程度的影响，可能需要优化筛选条件来提高筛选效率；此外，这种方法长期暴露于药物压力下可能导致耐药性突变的出现，降低筛选的准确性。

7、因此，现有技术仍有待于改进和发展。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于mcherry的筛选系统及其构建方法与应用，旨在解决现有细胞杂交体的筛选系统适用性有限、准确度不足且筛选过程中操作复杂的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供一种基于mcherry的筛选系统，包括：表达载体a和表达载体b；

4、所述表达载体a的编码框中包含mcherry-nsplit-linker1片段，所述mcherry-nsplit-linker1片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述表达载体b的编码框中包含linker2-csplit-mcherry片段，所述linker2-csplit-mcherry片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、优选的技术方案，所述表达载体a的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述表达载体b的核苷酸序列如seq id no.4所示。

7、本发明的第二方面，提供一种如第一方面所述的筛选系统的构建方法，包括：

8、将mcherry荧光蛋白拆分为两段，其中，1-159号氨基酸作为n端，160-236号氨基酸作为c端，根据所述n端和c端的氨基酸序列设计得到所述n端和c端的核苷酸序列；

9、在所述n端的核苷酸序列后添加连接序列和linker1，设计得到如seq id no.1所示的mcherry-nsplit-linker1片段的核苷酸序列；

10、在所述c端的核苷酸序列前添加linker2和连接序列，设计得到如seq id no.2所示的linker2-csplit-mcherry片段的核苷酸序列；

11、合成所述mcherry-nsplit-linker1片段，将所述mcherry-nsplit-linker1片段插入第一表达载体的编码框中，得到表达载体a；

12、合成所述linker2-csplit-mcherry片段，将所述linker2-csplit-mcherry片段插入第二表达载体的编码框中，得到表达载体b。

13、优选的技术方案，所述mcherry-nsplit-linker1片段通过同源重组插入第一表达载体的编码框中。

14、优选的技术方案，所述linker2-csplit-mcherry片段通过同源重组插入第二表达载体的编码框中。

15、本发明的第三方面，提供一种如第一方面所述的筛选系统的应用，将所述筛选系统应用于细胞杂交体的筛选。

16、优选的技术方案，所述细胞杂交体为裂殖酵母杂交体。

17、优选的技术方案，所述将所述筛选系统应用于细胞杂交体的筛选的方法，包括：

18、将表达载体a转入第一宿主细胞中，得到细胞a；

19、将表达载体b转入第二宿主细胞中，得到细胞b；

20、将所述细胞a和所述细胞b进行杂交，通过检测荧光信号，筛选得到所述细胞a和所述细胞b的细胞杂交体。

21、优选的技术方案，所述荧光信号的激发波长为550～620nm，发射波长为590～650nm。

22、有益效果：本发明的筛选系统应用时将表达载体a和表达载体b分别转入待杂交的宿主细胞中，杂交成功的宿主细胞中同时存在表达载体a和表达载体b，能够重组表达mcherry荧光蛋白，因而能够通过检测荧光信号筛选细胞杂交体。与现有技术相比，本发明的筛选系统具有如下优势：①可以与高通量筛选技术结合使用，使得同时处理大量样本变得更加容易。②可视化：荧光信号可通过显微镜观察，使得对细胞杂交情况有直观的了解。③高度特异性：可以实现对杂交事件的高灵敏检测，有助于准确判断杂交事件的发生与否，使得筛选结果更为精确和可靠。④操作简便，省时省力，该筛选系统应用时无需复杂的实验操作，只需要进行简单的转化和培养即可完成杂交鉴定，提高了筛选效率。⑤成本低廉：该筛选系统应用时所需的实验材料和设备成本较低，适用于各类实验室和生产场景。