用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的配对纳米抗体及应用

本发明属于生物医药，涉及用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的配对纳米抗体及应用。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌之一，可引起严重的葡萄球菌食物中毒（sfp），其致病性主要依赖于葡萄球菌肠毒素(ses)。这些ses是结构相似的毒性蛋白质。其中葡萄球菌肠毒素a（sea）因其毒性最强，最为常见。葡萄球菌肠毒素a具有优异的热稳定性和抗蛋白水解消化性，常规的食品加工过程难以破坏葡萄球菌肠毒素a的毒性。因此，开发灵敏、快速的葡萄球菌肠毒素a检测方法对于食品安全、临床诊断和环境监测至关重要。

2、当前，已经报道了各种各样的检测不同样品（食品、水、甚至体液、）中的葡萄球菌肠毒素方法。包括，酶联免疫吸附测定(elisa)、试纸条、电化学分析以及生物传感器等等。其实基于抗原抗体识别的elisa，由于其通量高、操作简单以及自动化程度高等优点，是当前应用最广泛的葡萄球菌肠毒素a快速筛查方法。然而，葡萄球菌蛋白a（spa）是普遍存在于金黄色葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，其可与常见哺乳动物（猪、豚鼠、小鼠、狗和猴等）免疫球蛋白的可结晶片段（fc）区发生强烈的非特异性结合，从而导致基于igg型抗体检测葡萄球菌肠毒素a的免疫分析方法易出现假阳性结果。

3、单域重链抗体，也被称为纳米抗体是一类源于骆驼科体内天然缺失轻链，即重链抗体的可变区，其分子量仅为传统igg型抗体的十分之一（约15kda）。近年来纳米抗体在生命科学研究、药物开发、医学诊断、食品安全、环境监控等领域获得了广泛的关注，主要是因为其相比较传统的igg型抗体，具有以下优势：分子量小、亲和力高、稳定性强、溶解度好、组织穿透性强以及可识别隐藏抗原表位。纳米抗体在各项性能方面具有优势，可为解决葡萄球菌蛋白a（spa）在葡萄球菌肠毒素a（sea）免疫分析中的干扰问题提供另外一种有吸引力的免疫试剂选择。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的配对纳米抗体及应用。筛选获得的配对纳米抗体，可避免检测sea时的spa干扰，为减少sea的危害提供了有力的工具。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、一种用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的配对纳米抗体，包括纳米抗体sea-4-03和纳米抗体sea-4-05，所述纳米抗体sea-4-03的氨基酸序列如seqidno：1所示，所述纳米抗体sea-4-05的氨基酸序列如seqidno：2所示。

4、进一步地，所述纳米抗体sea-4-03包括单体、二价抗体、多价抗体中的至少一种；所述纳米抗体sea-4-05包括单体、二价抗体、多价抗体中的至少一种。

5、一种包含所述配对纳米抗体的衍生产品，所述衍生产品选自以下a、b、c和d中的任意一种：

6、a：一种核酸分子，所述核酸分子编码所述配对纳米抗体；

7、b：一种重组载体，所述重组载体上包含编码所述配对纳米抗体的核酸分子，或，所述重组载体表达所述配对纳米抗体；

8、c：一种宿主细胞，所述宿主细胞中表达所述配对纳米抗体，或者，含有编码所述配对纳米抗体的核酸分子或b所述重组载体；

9、d：一种药物组合物，所述药物组合物含有所述配对纳米抗体、或a、b、c中至少一种。

10、进一步地，所述药物组合物中还含有一种或更多种药学上可接受的载体。

11、本发明还提供了所述配对纳米抗体构建的重组蛋白。

12、本发明还提供了所述配对纳米抗体在制备金黄色葡萄球菌肠毒素a抑制药物中的应用。

13、本发明还提供了所述配对纳米抗体在制备金黄色葡萄球菌肠毒素a免疫学检测试剂中的应用。

14、本发明还提供了所述配对纳米抗体在制备金黄色葡萄球菌肠毒素a免疫检测试剂盒中的应用。

15、本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素a免疫检测试剂盒，所述的试剂盒携带所述的配对纳米抗体。

16、本发明还提供了用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的配对纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

17、步骤一、纳米抗体的筛选：

18、将sea抗原用磷酸盐缓冲液稀释，加入到96孔板中，37℃下孵育1 h，随后使用pbst溶液洗涤；

19、洗涤完成后，加入3%蛋白封闭液，37℃下孵育2 h，随后使用pbst溶液洗涤；

20、洗涤完成后，加入噬菌体展示天然纳米抗体库，37℃下孵育，随后使用pbst溶液洗涤；

21、洗涤完成后，加入ph=2.2的gly-hcl洗脱液，水平摇床上反应，随后加入ph=9.0的tris-hcl中和缓冲液，得到中和噬菌体溶液；

22、取样中和噬菌体溶液测滴度，剩余中和噬菌体溶液用于侵染er2738以扩增噬菌体，并进行下一轮筛选；

23、步骤二、通过噬菌体-elisa鉴定抗sea纳米抗体：

24、进行第4轮筛选时，在测定洗脱噬菌体滴度的平板上随机挑选16个克隆进行噬菌体扩增；

25、使用pbs缓冲液分别将sea抗原和bsa浓度稀释至0.5μg/ml，加入96孔板中，100μl/孔，4℃包被12h；

26、使用pbst溶液洗涤3次，将3％的bsa加入96孔板中，300μl/孔，37℃封闭2h；

27、使用pbst溶液洗涤3次，每孔加入100μl噬菌体扩增液，37℃孵育1h；

28、使用pbst溶液洗涤3次，每孔加入100μl稀释后的hrp-m13二抗，37℃孵育1h；

29、使用pbst溶液洗涤3次，每孔加入100μl tmb显色液，37℃避光反应10min，反应结束后，每孔加入50μl 2mol/l h2so4终止液；

30、使用酶标仪测定450nm处的吸收值；选取od450大于对照10倍的实验组噬菌体克隆为阳性克隆，对阳性克隆进行测序，共得到2条不同氨基酸序列，分别命名为sea-4-03或sea-4-05；纳米抗体sea-4-03的氨基酸序列如seq id no：1所示，纳米抗体sea-4-05的氨基酸序列如seq id no：2所示。

31、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

32、1.本发明提供的配对纳米抗体的制备方法流程简单、成本低；

33、2.本发明提供的配对纳米抗体能够夹心结合sea，可以应用于开发检测sea的双抗夹心免疫分析方法、抗原富集纯化、中和药物开发等领域；

34、3.本发明提供的配对纳米抗体的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质（产量、水溶性、亲和力、特异性、稳定性等）更好的突变体。

35、4．本发明提供的配对纳米抗体，在构建检测sea免疫分析方法时，可以避免spa的干扰。

技术特征：

1.一种用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的配对纳米抗体，其特征在于，包括纳米抗体sea-4-03和纳米抗体sea-4-05，所述纳米抗体sea-4-03的氨基酸序列如seqidno：1所示，所述纳米抗体sea-4-05的氨基酸序列如seqidno：2所示。

2.如权利要求1所述的配对纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体sea-4-03包括单体、二价抗体、多价抗体中的至少一种；所述纳米抗体sea-4-05包括单体、二价抗体、多价抗体中的至少一种。

3.一种包含权利要求1所述配对纳米抗体的衍生产品，其特征在于，所述衍生产品选自以下a、b、c和d中的任意一种：

4.如权利要求1所述的配对纳米抗体构建的重组蛋白。

5.如权利要求1所述的配对纳米抗体在制备金黄色葡萄球菌肠毒素a抑制药物中的应用。

6.如权利要求1所述的配对纳米抗体在制备金黄色葡萄球菌肠毒素a免疫学检测试剂中的应用。

7.如权利要求1所述的配对纳米抗体在制备金黄色葡萄球菌肠毒素a免疫检测试剂盒中的应用。

8.一种金黄色葡萄球菌肠毒素a免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒携带权利要求1所述的配对纳米抗体。

9.一种用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素a的配对纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的配对纳米抗体及应用，配对纳米抗体包括纳米抗体SEA‑4‑03和纳米抗体SEA‑4‑05，所述纳米抗体SEA‑4‑03的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述纳米抗体SEA‑4‑05的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明的配对纳米抗体，可避免检测SEA时的SpA干扰，可用于免疫检测、药物开发等领域。技术研发人员：刘蓬,陈奇,胡乘浩受保护的技术使用者：南昌大学第一附属医院技术研发日：技术公布日：2024/11/18