一种NH2-PEG4-RK(Dde)-OH的合成方法与流程

本发明涉及有机合成，具体涉及一种nh2-peg4-rk(dde)-oh的合成方法。

背景技术：

1、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，her2)为一种酪氨酸激酶受体，是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)家族成员之一。her2 的扩增及过表达与肿瘤的高侵袭性、高复发性及高死亡率密切相关，其在多种恶性肿瘤中(如乳腺癌、胃癌、肺癌等)存在不同程度的高表达，是分子影像诊断及靶向治疗(单克隆抗体、抗体-药物偶联物等)的重要靶点。her2的致癌机制主要包括：促进肿瘤细胞增殖、增加肿瘤细胞侵袭力、抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤血管及淋巴管生成，从而为肿瘤的生长和转移提供有利条件。

2、目前，常用的her2靶向配体有抗体、小分子多肽或者与受体特异性结合的蛋白等。在癌症治疗中，肽可以用作靶向配体，特异性地将细胞毒性药物输送到肿瘤血管系统、肿瘤微环境或癌细胞中。另一方面，肽也可以在细胞内传递以靶向癌症特异性上调的转录因子、癌基因或酶。在诊断成像中，短肽具有良好的穿透性，能深入实体瘤内部，代谢周期短、能快速从循环中清除，具有毒性低的优点。通过在微阵列上进行原位单株测序这一高效的多肽筛选方式，两个新型8肽ylffvfer(h6)和klrlewnr(h10)引起了人们的重视，h6和h10的探针也显示了在her2阳性肿瘤组织中的高特异性和亲和力。h6和h10的kd分别为6.70×10-8mol/l和3.04×10-8mmol/l。h6的血浆半衰期为17分钟，h10的血浆半衰期为13分钟，由于h10半衰期较短，h10在血液中的清除速度可能比h6更快，具有更低的毒性。

3、klrlewnr(h10)的结构为：赖氨酸-亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-谷氨酸-色氨酸-天冬酰胺-精氨酸，结构式如下：

4、

5、现有的klrlewnr(h10)修饰方法为：将其中的h10肽链进行结构修饰，保留该肽链的完整性，将c、n两端交换，并在精氨酸上偶联一个末端带氨基的peg长链，既可以增加整条肽链的水溶性，也使得该靶向化合物可以作为中间体和抗癌药相偶联，实现肿瘤的精准治疗，修饰后的化合物结构如下：

6、

7、该化合物的结构简式为：nh2-peg4-arg-asn-trp-glu-leu-arg-leu-lys(dde)-oh；英文名：n2-(1-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oyl)-l-arginyl-l-asparaginyl-l-tryptophyl-l-glutamyl-l-leucyl-l-arginyl-l-leucyl-n6-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl]-l-lysine；中文名：n2-(1-氨基-3,6,9,12-四氧十五烷-15-氧代)-l-精氨酰-l-天冬酰胺基-l-色氨酰基-l-谷氨酰-l-亮氨酸-l-精氨酰基-l-亮氨酸-n6-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基]-l-赖氨酸；简称：nh2-peg4-rk(dde)-oh。

8、采用常规固相合成逐个连接法制得的nh2-peg4-rk(dde)-oh粗品纯度较低，杂质多，某些杂质与主成分的结构具有相似性，‌导致色谱行为与主成分相近，‌从而增加了分离的难度，需要经过多次hplc制备纯化。另外nh2-peg4-rk(dde)-oh含有‌asn残基，在多次制备纯化的过程中，发现有‌asn水解形成asp的现象。‌而在通过一系列工艺改进，如加大保护氨基酸的投料比、改变缩合剂种类、降低树脂的替代度等措施下，nh2-peg4-rk(dde)-oh粗品的纯度并没有显著提高。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对上述nh2-peg4-rk(dde)-oh合成困难的问题，提供一种提高产物纯度的合成方法。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

3、一种nh2-peg4-rk(dde)-oh的合成方法，采用分段合成法合成nh2-peg4-rk(dde)-oh，所述的分段合成法为两段法或三段法；所述的两段法以5-glu作为一个碳端位点，使nh2-peg4-rk(dde)-oh通过两个合成片段合成：片段wang-(9-6)-nh2和片段fmoc-(1-5)-oh；

4、所述三段法以3-asn、6-leu分别作为两个碳端位点，使nh2-peg4-rk(dde)-oh通过三个合成片段合成：片段wang-(9-7)-nh2、片段fmoc-(4-6)-oh和片段fmoc-(1-3)-oh；

5、将合成片段通过缩合剂偶联。

6、两段法中，反应物为片段wang-(9-6)-nh2、片段fmoc-(1-5)-oh、hatu、hoat和dipea，优选地，反应摩尔比为片段1：1.5：2.0：2.0：4.0；三段法中，反应物为片段wang-(9-7)-nh2、片段fmoc-(4-6)-oh、片段fmoc-(1-3)-oh、hatu、hoat、dipea，优选地，反应摩尔比为1：1.5： 1.5：2.0：2.0：4.0；反应后采用wang树脂裂解液洗脱得到产物，优选地，wang树脂裂解液为tfa：tips：h2o=95：2.5：2.5，v/v，混合均匀，冷冻至5±5℃；反应得到的粗品经过hplc精制。

7、所述片段wang-(9-6)-nh2的合成方法为使wang-lys(dde) 与保护氨基酸、hbtu以及dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：3.0：3.0：3.0。

8、所述wang-lys(dde)的合成方法为使wang树脂与fmoc-lys(dde)-oh、hobt、dic以及dmap反应，优选地，反应摩尔比为1.0：2.5：2.5：2.5：0.05。

9、所述片段fmoc-(1-5)-oh的合成方法为使ctc-glu(otbu) 与保护氨基酸、hbtu以及dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：3.0：3.0：3.0；反应后采用ctc树脂裂解液洗脱得到产物，优选地，ctc树脂裂解液为tfa：dcm=1：99，v/v，混合均匀，冷冻至5±5℃。

10、所述ctc-glu(otbu)的合成方法为使ctc树脂与fmoc-glu(otbu)-oh以及dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：2.0：4.0。

11、所述片段wang-(9-7)-nh2的合成方法为使wang-lys(dde) 与保护氨基酸、hbtu以及dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：3.0：3.0：3.0。

12、所述片段fmoc-(4-6)-oh的合成方法为使ctc-leu与保护氨基酸、hbtu、dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：3.0：3.0：3.0；反应后采用ctc树脂裂解液洗脱得到产物，优选地，ctc树脂裂解液为tfa：dcm=1：99，v/v，混合均匀，冷冻至5±5℃。

13、所述ctc-leu的合成方法为使ctc树脂与fmoc-leu-oh、dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：2.0：4.0。

14、所述片段fmoc-(1-3)-oh的合成方法为使ctc-asn(trt) 与保护氨基酸、hbtu以及dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：3.0：3.0：3.0；反应后采用ctc树脂裂解液洗脱得到产物，优选地，ctc树脂裂解液为tfa：dcm=1：99，v/v，混合均匀，冷冻至5±5℃。

15、所述ctc-asn(trt)的合成方法为使ctc树脂与fmoc-asn(trt)-oh、dipea反应，优选地，反应摩尔比为1.0：2.0：4.0。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

17、本发明提出了一种nh2-peg4-rk(dde)-oh的分段合成方法，能够解决通过固相合成制备nh2-peg4-rk(dde)-oh时易形成困难序列，在逐个偶联过程中易形成缺失肽、错接肽，导致粗品纯度差、结构相似杂质较多，使得制备纯化困难，影响产品纯度和收率的问题。

18、本发明研究了nh2-peg4-rk(dde)-oh的多种分段合成方式，经考察获得了最适合nh2-peg4-rk(dde)-oh合成的分段合成方法；该方法的工艺过程简单，且产品纯度和收率高，适于nh2-peg4-rk(dde)-oh的工业化生产。