一种手性医药中间体的酶法合成

本发明涉及酶工程，尤其涉及一种手性医药中间体的酶法合成。

背景技术：

1、l-哌啶-2-甲酸(l-pipecolic acid,l-pa)是一种有机化合物，其是合成许多重要药物群的关键手性成分，如局麻药罗哌卡因、布比卡因和氯普鲁卡因，同时l-哌啶-2-甲酸也是合成主要的大环内酯类化合物免疫制剂的中间体，如雷帕霉素、硫利达嗪和安莎霉素。与其他对映体的制备类似，纯l-pa主要通过化学对映选择性合成和立体选择性转化制备。然而，商业规模制备l-pa的化学方法需要有害的底物、昂贵的金属催化剂和复杂的产品纯化过程，或者步骤比较繁琐、且产率以及选择性较低。

2、而微生物酶法则具有反应条件温和、反应设备简单、反应初始底物廉价易得、污染低等优点。目前微生物酶法催化合成l-哌啶-2-甲酸主要是通过两种途径：(1)利用葡萄糖脱氢酶、△1-哌啶-2-羧化酶还原酶和l-赖氨酸α-氧化酶进行三酶耦连反应，但是这种方法催化反应时间长，同时得率低；(2)利用赖氨酸环化脱氨酶(lysine cyclodeaminase,lcd)通过结合环化和脱氨过程，一步催化线性l-赖氨酸杂环转化为环状l-pa，但由于可溶性蛋白表达水平低，底物和产物抑制严重，无法实现l-pa的有效积累。

3、尽管目前有较多研究者们通过研究生物酶法催化合成l-哌啶-2-甲酸，但主要是通过两种及以上的多种酶进行生物催化或者利用工程菌株高密度、长时间发酵进行l-哌啶-2-甲酸的合成，而对于利用赖氨酸环化脱氨酶进行一步酶法催化l-赖氨酸合成l-哌啶-2-甲酸的方法研究较少，然而从初期成本投入、原子经济性和环境绿色友好性等多个方面来看，一步酶法具有很大的优势和可行性。

4、然而，天然来源的赖氨酸环化脱氨酶在较高的反应温度(50℃)下具有很好的活性，但是在常温如25℃下催化活性急剧降低，大大降低了其工业化应用的潜力。因此，通过提高l-哌啶-2-甲酸合成中赖氨酸环化脱氨酶的活性进而提高l-哌啶-2-甲酸产量，具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，第一方面，本发明提供了一种赖氨酸环化脱氨酶、突变体，其能够催化合成l-哌啶-2-甲酸。

2、本发明解决上述问题的技术方案如下：

3、本发明提供了一种赖氨酸环化脱氨酶，所述赖氨酸环化脱氨酶来源于streptomyces pristinaespiralis；所述赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列为seq id no.1；所述赖氨酸环化脱氨酶的编码基因的核苷酸序列为seq id no.6。

4、本发明还提供了一种赖氨酸环化脱氨酶突变体，所述赖氨酸环化脱氨酶突变体为上述的赖氨酸环化脱氨酶的突变体；所述赖氨酸环化脱氨酶突变体为相对于野生型赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列seq id no.1，仅存在第148位的丙氨酸突变、第212位的丙氨酸突变中的一个突变或组合突变。

5、作为优选，所述赖氨酸环化脱氨酶突变体为相对于所述赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列seq id no.1，仅存在第148位的丙氨酸突变为甲硫氨酸、第148位的丙氨酸突变为亮氨酸、第212位的丙氨酸突变为缬氨酸、第212位的丙氨酸突变为精氨酸，中的一个突变或组合突变。

6、作为优选，所述赖氨酸环化脱氨酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq idno.3、seq id no.4、seq id no.5所示。

7、本发明还提供了一种编码基因，所述编码基因为编码上述的赖氨酸环化脱氨酶突变体的基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seqid no.10所示。

8、相对于野生型赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列seq id no.1，仅存在第148位丙氨酸突变为甲硫氨酸，将得到的赖氨酸环化脱氨酶突变体命名为splcd-a148m，其氨基酸序列为seq id n0.2，其编码基因的核苷酸序列为seq id n0.7。

9、相对于野生型赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列seq id no.1，仅存在第148位丙氨酸突变为亮氨酸，将得到的赖氨酸环化脱氨酶突变体命名为splcd-a148l，其氨基酸序列为seq id n0.3，其编码基因的核苷酸序列为seq id n0.8。

10、相对于野生型赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列seq id no.1，仅存在第212位丙氨酸突变为缬氨酸，将得到的赖氨酸环化脱氨酶突变体命名为splcd-a212v，其氨基酸序列为seq id n0.4，其编码基因的核苷酸序列为seq id n0.9。

11、相对于野生型赖氨酸环化脱氨酶的氨基酸序列seq id no.1，仅存在第212位丙氨酸突变为精氨酸，将得到的赖氨酸环化脱氨酶突变体命名为splcd-a212r，其氨基酸序列为seq id n0.5，其编码基因的核苷酸序列为seq id n0.10。

12、上述赖氨酸环化脱氨酶及其突变体碱基序列全长均为1083bp，从第一个碱基起至第1083个碱基止，起始密码子为atg，终止密码子为taa。

13、本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有上述赖氨酸环化脱氨酶或突变体的编码基因。

14、进一步优选，所述重组载体为pet-28a(+)。

15、本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌中导入了上述重组载体。

16、进一步优选，所述基因工程菌为e.coli bl21(de3)。

17、本发明上述赖氨酸环化脱氨酶突变体的获取是采用nnk密码子定点饱和突变技术，使用该技术对赖氨酸环化脱氨酶(seq id no.1)进行突变，将获得的突变质粒以42℃热击方式转入e.coli bl21(de3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收。

18、具体方法如下：第一步将野生型出发菌株活化，获得了野生型出发e.coli bl21(de3)/pet28a(+)-splcd，提取质粒pet28a(+)-splcd，并保存于-20℃。第二步通过alphafold进行三维建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选择的主要位点是底物进入活性中心的底物通道上的氨基酸残基，设计nnk密码子突变引物，以pet28a(+)-splcd为模板质粒，进行定点饱和突变，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，获得赖氨酸环化脱氨酶突变体splcd-a148m(记为a148m)、splcd-a148l(记为a148l)、splcd-a212v(记为a212v)、splcd-a212r(记为a212r)。

19、第二方面，本发明还提供了一种合成l-哌啶-2-甲酸的方法，以l-赖氨酸为主要底物，以上述赖氨酸环化脱氨酶或赖氨酸环化脱氨酶突变体为生物催化剂，在缓冲溶液中进行催化反应，合成l-哌啶-2-甲酸。

20、作为优选，所述赖氨酸环化脱氨酶或突变体的加入形式包括：包含所述赖氨酸环化脱氨酶或突变体的基因工程菌湿菌体、表达所赖氨酸环化脱氨酶及其突变体的细胞破碎液或所述赖氨酸环化脱氨酶及其突变体的基因工程菌湿菌体经细胞破碎、蛋白纯化后分离出的纯酶液。

21、作为优选，催化反应体系中，所述l-赖氨酸的浓度为50～150g/l，菌体浓度为50～150g wcw/l。

22、作为优选，所述催化反应中添加硫酸亚铁作为辅因子、添加triton作为细胞表面活性剂。

23、进一步优选，所述硫酸亚铁浓度为0.01～10mm；所述triton浓度为1％～5％。

24、作为优选，所述催化反应温度为25～55℃。

25、进一步优选，所述催化反应温度为30～40℃。

26、作为优选，所述缓冲溶液选自k2hpo4-kh2po4、tris-hcl和hepes-naoh缓冲液中的一种或多种。

27、作为优选，所述催化反应的ph为6.5～7.5。

28、本发明还提供了上述湿菌体的制备方法：将含赖氨酸环化脱氨酶或突变体基因的工程菌接种到含终浓度50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度2.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.1mm异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside，iptg)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含赖氨酸环化脱氨酶或突变体基因的湿菌体。

29、第三方面，本发明提供了一种用于检测反应液中l-哌啶-2-甲酸的方法。

30、衍生化：将样品15微升用100mm硼酸盐缓冲液285微升稀释。稀释后的样品用5.8mmfmoc-cl在丙酮(300微升)中衍生，剧烈混合，反应40分钟。用600微升25％乙腈/250mm硼酸盐缓冲液对混合物进行淬火。

31、hplc检测：色谱柱为welch c185u(250mm×4.6mm)；检测器为uv检测器，检测波长为254nm。运行时柱温设定为40℃，流速为1.5ml/min，进样量为10微升。流动相a为50mm80％乙酸钠/20％乙腈，流动相b为50mm 20％乙酸钠/80％乙腈；流动相比例梯度如下表：

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34、本发明具有以下有益效果：

35、本发明对来源于streptomyces pristinaespiralis的野生型赖氨酸环化脱氨酶进行定点饱和突变，得到突变体a148m、a148l、a212v和a212r，其酶活分别为野生型赖氨酸环化脱氨酶酶活的188.4％、211.6％、139.6％和165.1％；并以赖氨酸环化脱氨酶或突变体作为生物催化剂，以l-赖氨酸为主要底物，一步合成手性医药中间体l-哌啶-2-甲酸(l-pa)，其中a148m突变体反应92h后，生成l-pa产量为102.80g/l，较野生型赖氨酸环化脱氨酶提高了21.9g/l，底物转化率达到68.53％，时空产率为1.18g/l·h，而利用野生型赖氨酸环化脱氨酶催化生成l-pa最大产量为80.81g/l；因此赖氨酸环化脱氨酶突变体能够用于高产率、高选择性的催化合成l-哌啶-2-甲酸，且此合成方法绿色环保、工艺简单易操作，有利于大规模生产。