一种柴胡bHLH转录因子BcbHLH1基因及其应用

本发明涉及生物基因工程，具体涉及一种柴胡bhlh转录因子bcbhlh1基因及其应用。

背景技术：

1、柴胡(bupleuri radix)为常用大宗药材，主要药效成分为五环三萜类的柴胡皂苷(saikosaponins，sss)。sss是评价柴胡药材品质的重要指标，具有广泛的药用价值，但在柴胡中的含量较低，同时受到遗传背景、组织器官、生长阶段、种植环境和产地等因素的影响。且由于柴胡皂苷的结构复杂通过化学方式合成难度较大，难以满足日益增长的市场需求。分子育种及代谢工程为实现其大量生产提供了可能，但sss代谢调控机制研究仍处于空白，大量参与合成的关键酶和转录调控基因还未被发掘，严重制约着柴胡基因工程和代谢工程发展。

2、研究表明植物次生代谢产物的合成与释放具有空间特异性(组织器官)和时间特异性(发育时期)，并受到环境因子和外源诱导子的影响。bhlh、myb、wrky、bzip、ap2/erf等转录因子，在萜类次生代谢生物合成中起着重要的调控作用，决定了合成酶基因的时空表达和诱导表达的特异性和高效性。利用次级代谢产物的时空表达差异性和应激响应特性，识别调节次级代谢产物的关键转录因子，是目前解析次生代谢产物调控机制的策略。

3、在柴胡不同生长阶段和组织器官中sss的含量与组成具有显著差异，且与sss合成相关的酶基因表达量也存在差异。sss的积累具有时空特异性，并且受到环境和外源诱导子的影响。因此挖掘更多参与sss合成的转录因子和相关酶基因，这对解析sss代谢调控网络、生物合成路径和实现柴胡的分子育种具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、为了进一步挖掘参与sss合成的转录因子和相关酶基因，本发明提供一种柴胡bhlh转录因子bcbhlh1基因及其应用。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种柴胡bhlh转录因子bcbhlh1基因，其核苷酸序列如seqid no:1所示。

4、第二方面，本发明提供第一方面所述的bcbhlh1基因的编码蛋白质，其氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、第三方面，本发明提供含有如第一方面所述的柴胡bhlh转录因子bcbhlh1基因的表达载体。

6、第四方面，本发明提供含有如第一方面所述的bcbhlh1基因或者第三方面所述的表达载体的重组宿主细胞。

7、优选地，所述细胞选自：细菌、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。

8、第五方面，本发明提供第一方面所述的bcbhlh1基因或者第二方面所述的蛋白质或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的重组宿主细胞在促进柴胡叶片中柴胡皂苷合成的应用。

9、优选地，第一方面所述的bcbhlh1基因或者第二方面所述的蛋白质或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的重组宿主细胞通过瞬时转化柴胡叶片促进柴胡叶片中柴胡皂苷合成。

10、第六方面，本发明提供一种柴胡叶片瞬时转化试剂，其包括浸染液，所述浸染液含有第一方面所述的bcbhlh1基因或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的重组宿主细胞。

11、第七方面，本发明提供第六方面所述的含有重组宿主细胞的柴胡叶片瞬时转化试剂的构建方法，包括如下步骤：

12、步骤1，从柴胡中提取总rna，并反转录成cdna，作为pcr模板，通过pcr方法获得扩增产物，将所述扩增产物纯化后连接pnc-cam1304-subn载体，得到重组质粒bcbhlh1-pnc-cam1304-sub；

13、步骤2，以所述重组质粒bcbhlh1-pnc-cam1304-sub为模板，peaq-ht-dest1为载体，酶切位点为sali和xhoi，构建bcbhlh1-oe过表达重组质粒；

14、步骤3，将所述bcbhlh1-oe过表达重组质粒转化根癌农杆菌感受态细胞，获得阳性单克隆菌株；

15、步骤4，将所述阳性单克隆菌株的菌液加入到含卡那霉素和利福平的液体lb培养基中培养，培养结束后离心弃上清，加入含有乙酰丁香酮和mgcl2的mes溶液重悬菌体，获得侵染液，即为所述瞬时转化试剂；

16、优选地，所述步骤1中，pcr方法采用的引物序列如seq id no：5和seq id no：6所示；

17、优选地，所述液体lb培养基中，卡那霉素和利福平的终浓度分别为50μg/ml；

18、优选地，所述mes溶液中，乙酰丁香酮和mgcl2的终浓度分别为0.2mm和10mm。

19、第八方面，本发明提供第六方面所述的瞬时转化试剂在瞬时转化柴胡叶片合成柴胡皂苷中的应用。

20、第九方面，本发明提供一种通过瞬时转化柴胡叶片合成柴胡皂苷的方法，包括：将第八方面所述构建方法获得的瞬时转染试剂注射到柴胡下表皮，然后将注射完毕的柴胡植株培养。

21、优选地，所述将注射完毕的柴胡植株培养的方法为：在25℃下，将注射完毕的柴胡植株黑暗放置12小时后，然后按照光照培养12小时、黑暗培养12小时的方式循环培养2～4天。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

23、(1)本发明通过外源激素激活试验，首次挖掘到表达模式与柴胡皂苷积累趋势一致的关键转录因子bcbhlh1。通过全长克隆、亚细胞定位、组织表达特性、转录自激活等试验，分析bhlh家族中与柴胡皂苷代谢密切相关的bcbhlh1的表达模式；利用叶片瞬时过表达，验证了bcbhlh1促进柴胡皂苷合成的生物学功能，并对该调控机制进行了解析。

24、(2)本发明中建立的柴胡叶片瞬时转化体系，为柴胡皂苷合成相关功能基因验证提供了更加快速和高效的实验方法，对解析柴胡皂苷代谢调控网络和生物合成路径具有重要指导意义，为后续通过代谢工程技术实现工业化柴胡皂苷提取，通过基因工程技术对柴胡进行优良品种选育提供了理论基础，具有广泛的应用价值。

技术特征：

1.一种柴胡bhlh转录因子bcbhlh1基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的bcbhlh1基因的编码蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如seq idno:2所示。

3.含有如权利要求1所述的柴胡bhlh转录因子bcbhlh1基因的表达载体。

4.含有如权利要求1所述的bcbhlh1基因或者权利要求3所述的表达载体的重组宿主细胞。

5.权利要求1所述的bcbhlh1基因或者权利要求2所述的蛋白质或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的重组宿主细胞在促进柴胡叶片中柴胡皂苷合成的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的bcbhlh1基因或者权利要求2所述的蛋白质或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的重组宿主细胞通过瞬时转化柴胡叶片促进柴胡叶片中柴胡皂苷合成。

7.一种柴胡叶片瞬时转化试剂，其特征在于，其包括浸染液，所述浸染液含有权利要求1所述的bcbhlh1基因或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的重组宿主细胞。

8.权利要求7所述的含有重组宿主细胞的柴胡叶片瞬时转化试剂的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.权利要求7所述的瞬时转化试剂在瞬时转化柴胡叶片合成柴胡皂苷中的应用。

10.一种通过瞬时转化柴胡叶片合成柴胡皂苷的方法，其特征在于，包括：将权利要求8所述构建方法获得的瞬时转染试剂注射到柴胡下表皮，然后将注射完毕的柴胡植株培养；所述将注射完毕的柴胡植株培养的方法为：在25℃下，将注射完毕的柴胡植株黑暗放置12小时后，然后按照光照培养12小时、黑暗培养12小时的方式循环培养2~4天。

技术总结本发明提供一种柴胡bHLH转录因子BcbHLH1基因及其应用，该BcbHLH1基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过外源激素激活试验，首次挖掘到表达模式与柴胡皂苷积累趋势一致的关键转录因子BcbHLH1。通过全长克隆、亚细胞定位、组织表达特性、转录自激活等试验，分析bHLH家族中与柴胡皂苷代谢密切相关的BcbHLH1的表达模式；利用叶片瞬时过表达，验证了BcbHLH1促进柴胡皂苷合成的生物学功能，并对该调控机制进行了解析。技术研发人员：赵军,张梦,胡婷婷,李雪,余马,陈华,辛超受保护的技术使用者：西南科技大学技术研发日：技术公布日：2024/11/21