一种P450单加氧酶合成手性烷基环氧的方法

本发明涉及手性烷基取代环氧类化合物合成，具体而言，涉及一种p450单加氧酶突变体(命名为p450er)及其在生物合成手性烷基取代环氧类化合物的应用。

背景技术：

1、手性烷基取代环氧类化合物是一类非常重要的化合物,可作为香料、药物中间体以及催化剂，在有机合成和药物合成中有广泛的应用。现有的手性烷基取代环氧类化合物合成技术还存在着过度氧化、副产物多、反应条件苛刻等不足。生物催化的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备手性烷基取代环氧类化合物的新途径。但现有研究表明，高活性和高立体选择性的手性烷基取代环氧类化合物合成酶还十分匮乏，无法满足绿色工业化生产的需求，获得高催化效率的生物催化剂和相应的生物催化合成方法，仍然是手性烷基取代环氧类化合物生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种p450单加氧酶及其在生物合成手性烷基取代环氧类化合物的应用以解决上述技术问题。

2、本发明的技术方案：

3、一种手性烷基取代环氧类化合物的制备方法，其特征为烷基取代烯烃为底物、p450er单加氧酶催化剂，在水相条件下反应，反应式如下:

4、

5、                   

6、其中：

7、r为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、苯基、4-溴苯基、4-氯苯基、4-氟苯基、4-三氟甲基苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、4-乙基苯基、4-叔丁基苯基、4-正丁氧基苯基、3，4-二甲氧基苯基、3，5-二甲氧基苯基、3，4，5-三甲氧基苯基、3-氯-4-甲氧基苯基、3-溴-4-甲氧基苯基、3-溴苯基、4-碘苯基、4-氰基苯基、2-萘基、2-呋喃基。

8、本发明是这样实现的：

9、第一方面，本发明提供了一种p450单加氧酶突变体p450er，其氨基酸序列如seqid no.1所示。

10、本发明以p450da酶为模板经过基因改造获得的p450单加氧酶，核苷酸序列如seqid no.2所示，将其构建到基因工程菌上，经过诱导表达，获得了p450单加氧酶p450er。对该p450单加氧酶进行功能性研究，发现该p450单加氧酶具有生物合成手性烷基取代环氧类化合物的功能。相对于现有的手性烷基取代环氧类化合物的制备方法，使用本发明提供的p450单加氧酶进行生物合成手性烷基取代环氧类化合物，具有反应速率高，耗时短的技术优势；本发明提供的p450单加氧酶在合成手性烷基取代环氧类化合物时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和；此外，本发明提供的p450单加氧酶在合成手性烷基取代环氧类化合物时，不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此，本发明提供的p450单加氧酶具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便。

11、上述单加氧酶中含有血红素单元。

12、seq id no.1所示的氨基酸序列如下：

13、

14、第二方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的p450单加氧酶。

15、在本发明提供了上述p450单加氧酶的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述p450单加氧酶的核酸序列，这对本领域技术人员来说是容易实现的。

16、例如，分离的核酸分子具有如下seq id no.2所示的核苷酸序列：

17、

18、

19、

20、第三方面，本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子。

21、载体包括不限于细菌表达载体、真菌表达载体等，只要能实现上述核酸分子的表达、实现上述核酸分子的穿梭的载体均可行。包括不限于质粒等，细菌表达载体如大肠杆菌表达载体、链霉菌或分枝杆菌表达载体。真菌表达载体例如酵母载体。

22、第四方面，本发明还提供了一种重组菌，其包括上述的载体。在本发明应用较佳的实施方式中，重组菌为细菌或真菌；

23、在本发明应用较佳的实施方式中，细菌为大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

24、真菌例如酵母。

25、在本发明应用较佳的实施方式中，重组菌是指菌的休止细胞、重组菌的活细胞、重组菌的死菌和重组菌的细胞破碎物中的至少一种。

26、上述重组菌(或基因工程菌)，由通过本领域常规方法将重组表达载体转化至宿主微生物中制得；宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的p450单加氧酶基因可被有效表达即可；较佳地，可通过下述方法制得:将重组载体pet-28a(+)-p450转化至大肠杆菌bl21(de3)中。

27、重组菌的死菌包括不限于通过热、压力、辐射等方式灭活后获得的菌。

28、细胞破碎物是指：包括不限于通过超声、机械、化学、生物等方式使得细胞膜通透性改变，致使细胞内容物外泄，由此获得细胞破碎物。

29、第五方面，本发明还提供了一种固定化酶，通过载体或无载体的方法将上述的p450单加氧酶固定制得。

30、在本发明应用较佳的实施方式中，通过载体进行固定的方法选自吸附法、交联法和包埋法中的至少一种。

31、吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将酶吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。

32、交联法是采用双功能或多功能试剂与酶表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得酶被固定。

33、包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化酶。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将酶包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将酶与胶溶液混合，经造粒而成。

34、第六方面，本发明还提供了一种固定化细胞，将上述的菌或上述的细胞进行固定制得。

35、在本发明应用较佳的实施方式中，通过载体进行细胞固定的方法选自吸附法、共价结合法、交联法和微胶囊法中的至少一种。

36、吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将细胞吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。

37、共价结合法是利用细胞表面的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。

38、交联法是采用双功能或多功能试剂与细胞表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得细胞被固定。

39、包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化细胞。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将细胞与胶溶液混合，经造粒而成。

40、在本发明应用较佳的实施方式中，固定化细胞是活菌或死菌的固定化细胞。

41、第七方面，本发明还提供了p450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞在手性烷基取代环氧类化合物生物合成中的应用。

42、p450单加氧酶包括不限于纯化后的重组p450单加氧酶蛋白，含p450单加氧酶的粗酶液。

43、采用上述p450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞能够高效、快速、简便的在常温、常压及水相环境中实现手性烷基取代环氧类化合物生物合成，整个合成过程对环境友好，具有广阔的应用前景。

44、在本发明应用较佳的实施方式中，手性烷基取代环氧类化合物生物合成的底物为烷基取代烯烃。

45、第八方面，本发明还提供了一种生物合成手性烷基取代环氧类化合物的方法，采用上述的p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞与底物反应。

46、在本发明应用较佳的实施方式中，反应的温度是0-50℃；在上述反应温度下，具有较高的手性烷基取代环氧类化合物生物合成效率。

47、在本发明应用较佳的实施方式中，每10-50mm的底物与5-25ml的p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞的混合。

48、例如每10-20mm、10-25mm、30-40mm或35-50mm的底物与5-10ml、15-25ml或20-25ml的p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞的混合。

49、在本发明应用较佳的实施方式中，将p450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞置于缓冲液中，与底物混合后在200-250rpm摇床上进行反应。

50、在本发明应用较佳的实施方式中，将反应产物用有机溶剂进行萃取，经柱层析分析获得手性烷基取代环氧类化合物。在一种可选的实施方式中，上述有机溶剂选自容易与手性烷基取代环氧类化合物相容的有机溶剂，例如酯类、醇类。酯类例如乙酸乙酯。通过柱层析以获得纯化后的手性烷基取代环氧类化合物。

51、在本发明应用较佳的实施方式中，缓冲液为50-200mm浓度、ph 6-9的磷酸钠缓冲液。

52、采用上述技术方案的有益效果是：

53、本发明提供了一种p450单加氧酶，该p450单加氧酶具有生物合成手性烷基取代环氧类化合物的功能。相对于现有的手性烷基取代环氧类化合物的制备方法，使用本发明提供的p450单加氧酶进行生物合成手性烷基取代环氧类化合物，具有反应速率高，耗时短的技术优势。

54、本发明提供的p450单加氧酶在合成手性烷基取代环氧类化合物时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和。

55、此外，本发明提供的p450单加氧酶在合成手性烷基取代环氧类化合物时，不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此，本发明提供的p450单加氧酶具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便，具有广阔的应用前景。