核酸内切酶Gs12-7MAX变体及其介导的基因编辑系统的制作方法

本发明属于基因组编辑，具体地涉及一种核酸内切酶gs12-7max变体及其介导的基因编辑系统。

背景技术：

1、crispr/cas系统广泛用于人类细胞和动植物的基因组定点修饰、表观，碱基以及先导编辑等。常用的编辑系统来源于化脓性链球菌的crispr/cas9，除此之外，cas12a核酸核酸内切酶，包括来自acidaminococcus sp.的ascas12a和lachnospiraceae bacteriumnd2006的lbcas12a等也常被用于基因组编辑等。cas12a核酸内切酶，优势在于以下几个方面：首先它识别具有富含t的pam靶位点，扩展了基因组编辑靶向空间；只需要单个短～40个核苷酸(nt)的crispr rna(crrna)即可特异编辑靶标；具有rnase活性，可通过poly-crrna转录本加工实现多重靶向编辑；此外，有研究表明cas12a比spcas9更特异，脱靶效应更低。

2、尽管cas12a核酸酶已显示出多种优势，但目前仍受到编辑效率低的限制，因此迫切开发高效的基于cas12a基因组定点修饰的技术。基于此，本发明在前期通过生信和实验鉴定的gs12-7核酸内切酶(cn116144631a)基础上，进一步对其进行突变体改造，开发了gs12-7max变体及其介导的基因组定点修饰技术。

技术实现思路

1、本发明首次开发了一种gs12-7max变体，将gs12-7核酸内切酶的第157位氨基酸由glu突变为arg后，与野生型gs12-7相比具有更高的基因编辑活性，本发明还建立了基于crispr-gs12-7max系统介导的高效基因组定点修饰技术。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种核酸内切酶gs12-7max变体，包括以下蛋白：

4、i、seq id no.1所示氨基酸序列的gs12-7max蛋白，相对于野生型gs12-7核酸内切酶而言，第157位氨基酸由glu突变为arg。

5、ii、与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。

6、融合蛋白，包含上述核酸内切酶，以及与所述蛋白的n端或c端连接的多肽。

7、多核苷酸，所述多核苷酸为编码上述核酸内切酶的多核苷酸，或编码上述融合蛋白的多核苷酸。含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞。

8、上述核酸内切酶在基因编辑中的应用，包括原核生物基因组、真核生物基因组或体外基因的修饰基因、敲除基因、改变基因产物的表达、修复突变或插入多核苷酸。

9、crispr/gs12-7max基因编辑系统，包括上述核酸内切酶，或融合蛋白，或多核苷酸，或载体，或宿主细胞。进一步地，还包括能够结合上述核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列crrna。

10、本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：

11、1.本发明首次提供了一种具有较高基因编辑活性的gs12-7max变体，相对于野生型gs12-7而言，第157位氨基酸由glu突变为arg。

12、2.本发明开发了基于crispr/gs12-7max系统介导的高效基因编辑技术，在基因组定点修饰领域具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种crispr/gs12-7系统中的核酸内切酶变体，其特征在于，包括以下蛋白：

2.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述蛋白和其他修饰部分。

3.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述核酸内切酶变体的多核苷酸，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。

4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所的多核苷酸。

5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体。

6.权利要求1所述的核酸内切酶变体，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞在基因编辑中的应用。

7.一种crispr/gs12-7max基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要5所述的宿主细胞。

技术总结本发明公开了一种Gs12‑7核酸内切酶变体及其介导的基因编辑系统。具体地，通过理性突变策略构建2个Gs12‑7突变体并进行比较，发现将Gs12‑7核酸内切酶第157位氨基酸由Glu突变为Arg后，能显著提高该基因编辑酶的活性，并将此变体称为Gs12‑7MAX。本发明提供了基于CRISPR‑Gs12‑7MAX系统介导的高效基因编辑技术，在基因组定点修饰领域具有广阔的应用前景。技术研发人员：谢胜松,赵书红,李新云,陶大刚,李晟受保护的技术使用者：湖北洪山实验室技术研发日：技术公布日：2024/11/21