一种稳定表达猪瘟病毒疫苗株E2蛋白的悬浮HEK293细胞系的构建方法及应用

本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法及其应用，属于细胞生物学和动物基因工程疫苗。

背景技术：

1、猪瘟兔化弱毒疫苗（hclv）是防控古典猪瘟病毒（classical swine fever virus，csfv）感染最有效的疫苗，hclv是致弱的活疫苗，接种后诱导机体产生的血清抗体与野毒感染产生的抗体一致，因此，无法通过检测血清抗体的方法有效区分检测到的抗体是来自疫苗免疫还是和野毒感染，不利于于猪场的猪瘟防控和我国猪瘟的净化和根除目标的实现。

2、囊膜糖蛋白e2是csfv基因组编码的最主要免疫原性蛋白，是研制重组基因工程疫苗的首选抗原。利用真核系统体外表达的e2蛋白免疫猪，能够高效刺激猪体产生中和抗体，保护猪免遭猪瘟强毒株攻击。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法及应用。

2、本发明稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法，包括以下步骤：

3、（1）将csfv疫苗株e2基因表达盒克隆到pbhyb载体上获得重组表达质粒pb-e2；

4、csfv疫苗株e2基因表达盒包含分泌信号肽的编码序列、编码e2基因多核苷酸序列、氨基酸接头序列（5`-ggggs-3`）、多聚组氨酸标签序列；e2基因表达盒的氨基酸序列如seq id no.1所示；以hil-2作为分泌信号肽（氨基酸序列myrmqllscialslalvtns）；

5、pbhyb载体的构建方法：

6、以质粒piggybac dual promoter为模板、 p1和p2为引物扩增目的片段fra1，以质粒ptt5为模板、p3和p4为引物扩增目的片段fra2，以质粒pcep4为模板、p5和p6为引物扩增目的片段fra3，用dna同源重组酶重组fra1、fra2和fra3片段，得到pbhyb；

7、p1、p2、p3、p4、p5、p6的序列如下：

8、p1：5`-ttatgagggacagccgcgtacatttatattggctcatgtc-3`（seq id no.3）

9、p2：5`- ggctgtccctcataaaagttttg -3`（seq id no.4）

10、p3：5`-ttatgagggacagccgcgtacatttatattggctcatgtcc-3`（seq id no.5）

11、p4：5`-gctagtcgcatatgctattgaattagggttagtctgg -3`（seq id no.6）

12、p5：5`-gcatatgcgactagcttggcacg -3`（seq id no.7）

13、p6：5`-tatcagggacagcccggctgctggagatgg -3`（seq id no.8）。

14、（2）将重组表达质粒pb-e2、重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase和转染试剂pei用pei方法共转染hek-293悬浮细胞；重组表达质粒pb-e2、重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase和转染试剂pei的摩尔比为3:1:8。

15、重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase的构建：经密码子优化后获得具有高酶活性的转座酶（chypbase）基因片段（转座酶基因的序列如seq id no.2），通过限制性内切酶 hindⅲ和 notⅰ双酶切合成的转座酶基因片段，纯化后克隆至ptt5载体，得到重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase。

16、（3）通过杀稻瘟素进行抗性筛选获得表达重组表达质粒的阳性细胞克隆，进行多次传代培养，获得了可持续稳定分泌表达e2蛋白的hek-e2重组细胞系。

17、本发明还提供了悬浮hek293细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

18、综上所述，本发明以哺乳动物细胞hek-293为宿主细胞，其能够对囊膜糖蛋白e2蛋白进行糖基化修饰，从而是重组e2蛋白的结构和功能与天然病毒粒子上的e2蛋白几乎一致。为了能够获得能够稳定传代的、且可用于规模化工业生产的、高密度发酵的重组细胞株，我们构建了配套使用的来源于昆虫细胞的转座子-组成型辅助质粒，能够将e2基因靶向稳定整合到hek-293细胞染色体上基因组转录活性区，从而实现e2基因的高效翻译、转录和表达；通过在e2基因上增加增强蛋白分泌到细胞培养上清中的分泌性信号肽的基因和用于纯化蛋白的多聚组氨酸标签，从而简化目的蛋白的纯化程序。通过质粒共转染hek293细胞，利用杀稻瘟素抗性筛选阳性细胞克隆，进行扩大繁殖和悬浮培养，获得了可持续稳定分泌表达e2蛋白的hek-293重组细胞系，命名为hek-e2。在细胞稳定传代试验中证实，当hek-e2细胞株传至第10代时，培养上清中e2蛋白的表达量稳定，产量稳定保持在1.0 mg~1.2 mg/ml，说明e2基因已经稳定整合到宿主细胞的染色体上，亲和层析纯化获得的e2蛋白纯度达到95%以上，双抗体夹心elisa确定其具有很好的反应原性，206佐剂乳化e2蛋白免疫猪能够诱导高水平的血清抗体，攻击强毒后能够得到完全保护。本发明构建的hek-293细胞株能够稳定分泌表达的csfv e2蛋白，具备开发为重组e2基因工程疫苗的应用前景。

技术特征：

1.一种稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法，其特征在于：pbhyb载体的构建方法：

3.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法，其特征在于：重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase的构建：经密码子优化后获得具有高酶活性的转座酶基因片段，通过限制性内切酶hindⅲ和notⅰ双酶切合成的转座酶基因片段，纯化后克隆至ptt5载体上，得到重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase，转座酶基因的序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法，其特征在于：重组表达质粒pb-e2、重组转座酶辅助质粒ptt5-chypbase和转染试剂pei的摩尔比为3:1:8。

5.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系的构建方法，其特征在于：当hek-e2重组细胞系稳定传10代时，培养上清中e2蛋白的表达量稳定，产量稳定保持在1.0-1.2 mg/ml，亲和层析纯化获得的e2蛋白纯度达到95%。

6.根据权利要求1所述构建方法构建的稳定表达猪瘟病毒疫苗株e2蛋白的悬浮hek293细胞系。

技术总结本发明提供了一种稳定表达猪瘟病毒疫苗株E2蛋白的悬浮HEK293细胞系的构建方法。本发明构建了表达猪瘟病毒疫苗株E2蛋白的悬浮HEK293细胞系。在细胞稳定传代试验中证实，当HEK‑E2细胞系能够稳定传10代时，培养上清中E2蛋白的表达量稳定，产量稳定保持在1.0‑1.2 mg/ml，亲和层析纯化获得的E2蛋白纯度达到95%，双抗体夹心ELISA确定其具有很好的反应原性，206佐剂乳化E2蛋白免疫猪能够诱导高水平的血清抗体，攻击强毒后能够得到完全保护。本发明构建的HEK‑293细胞系能够稳定分泌表达的CSFV E2蛋白的具备开发为重组E2基因工程疫苗的应用前景。技术研发人员：尹双辉,郭慧琛,孙世琪,丁耀忠,尚佑军,谭书桢,张韵,白满元,董虎,吴金恩,周静静,腾志冬受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心）技术研发日：技术公布日：2024/12/23