一株强致病性小鹅瘟病毒及其卵黄抗体的制备方法与流程

本技术涉及微生物领域，更具体地说，它涉及一株强致病性小鹅瘟病毒及其卵黄抗体的制备方法。

背景技术：

1、小鹅瘟又称鹅细小病毒感染，是由鹅细小病毒(gooseparvovirus，gpv)引起的雏鹅和番鸭的一种高度接触性传染病；病雏鹅的临诊特点是精神委顿，食欲废绝，严重下痢，有时出现神经症状，死亡率高，感染的日龄越早，死亡率越高，是危害水禽业健康发展最严重的传染病之一，对水禽养殖造成巨大的经济损失。

2、小鹅瘟病毒属于细小病毒科，细小病毒属，单一血清型。gpv属于自主性病毒，无需借助其他病毒即可发生自我复制。自然条件下，可在鹅胚、番鸭胚或其成纤维细胞上进行增殖。

3、目前gpv的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体(immunoglobulinofyolk，igy)进行被动免疫，对gpv强毒感染具有明显的防治效果。由于igy具有价格低廉、防治效果好等优点，已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的igy多为粗制抗体，缺乏统一的生产、检验标准，琼扩抗体效价高低不等原因导致无法对该病进行有效的防控。

4、由于病毒的毒性直接影响到抗体的情况，所以需要筛选出强致病性的小鹅瘟病毒，制备的卵黄抗体具有纯度高、效价高，治疗防控效果好的优点。

技术实现思路

1、为了需要筛选出强致病性的小鹅瘟病毒，制备的卵黄抗体具有纯度高、效价高，治疗防控效果好的优点。

2、本技术提供一株强致病性小鹅瘟病毒及其卵黄抗体的制备方法。

3、第一方面，本技术提供一种小鹅瘟病毒，采用如下的技术方案：

4、一种小鹅瘟病毒，所述小鹅瘟病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为小鹅瘟病毒rd2311b-e21，保藏日期为2024年4月22日，保藏编号为cgmccno.45964。

5、通过采用上述技术方案，得到的小鹅瘟病毒具有强致病性，以此小鹅瘟病毒制备抗体，能够得到高抗性、纯度高的抗体，拓宽抗体的作用范围。

6、优选的，所述病毒分离纯化步骤如下：按1:1.8-2(w/v)的比例取病料组织添加到无菌pbs溶液中，然后进行研磨得到浆液，经冻融、离心处理，取上清液进行毒株分离，经过滤，保存，经过鹅胚尿囊腔盲传3代后，分离并纯化，得到小鹅瘟病毒rd2311b-e21。

7、优选的，所述病料组织为发病鹅的肝脏、肾脏、肠道中的一种或多种。

8、通过采用上述技术方案，将病料组织添加无菌pbs后研磨配合3代盲传，能够得到高致病性和高纯度的病毒，以此病毒制备抗体，能够使抗体具有高纯度、高效价、治疗防控效果好的优点。

9、由于病毒粒子与这些杂质在大小和密度上存在差异，离心时受到的离心力不同，所以通过离心处理，实现分离除杂；3代盲传实现了病毒的纯化。

10、第二方面，本技术提供一种小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备方法，采用如下的技术方案：

11、一种小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

12、s1、小鹅瘟病毒rd2311b-e21经增殖、灭活、制备免疫原；小鹅瘟病毒rd2311b-e21选用权利要求1-3任一项所述的小鹅瘟病毒rd2311b-e21；

13、s2、免疫原分别注射四次到蛋鸡中，得到四免蛋；

14、s3、将四免蛋经浓度0.08-0.12％的新洁尔灭溶液浸泡处理，然后沥干水分，去除表面污物，将四免蛋用浓度0.08-0.12％的戊二醛喷雾熏蒸28-32min，鸡蛋吹干后打蛋，然后进行蛋清蛋黄分离，得到蛋黄；

15、s4、按体积比1:0.8-1.2将蛋黄与浓度0.02-0.03mol/l的磷酸氢二钠溶液混合均匀，过滤去除杂质得到蛋黄液；在蛋黄液中添加2-2.2倍体积的磷酸氢二钠溶液，搅拌混合后，得到浊液；s5、按体积比1:0.8-1.2将浊液和沉降剂混合均匀，然后用柠檬酸溶液调节沉降液ph至6.0，在3-5℃条件下沉降处理10-14h，超滤除病毒、超滤浓缩、分装，得到成品。

16、通过采用上述技术方案，制备的卵黄抗体具有纯度高、效价高、治疗防控效果好的优点，进入小鹅体内，能够快速被机体的吸收而进入血液，对病毒实现标记，快速与病毒接触，中和病毒，终止病毒对机体的危害，从而缓解症状，恢复健康；并且高抗性的抗体能够增加机体的抗体贮备，抵御外来病毒的侵入，且抗体作用时间较长；同时卵黄抗体能够改良雏鹅精神萎靡、食欲不振、步行困难、严重下痢的症状，从而显著降低患病雏鹅的死亡率，提高治愈率。

17、优选的，所述s1中增殖具体步骤如下：

18、将小鹅瘟病毒rd2311b-e21经尿囊腔接种12日龄胚，弃去48h死胎，然后收集72-120h内死亡且病变的鹅胚的尿囊液及胚体，胚体破碎研磨后与尿囊液按照1:0.8-1.2的比例混合，然后经离心、上清液分装，得到抗原。

19、通过采用上述技术方案，利用尿囊胚的环境，快速增值小鹅瘟病毒，尿囊胚含有丰富的血管网，能够为病毒提供良好的生长环境，利用细胞内的生物合成机制进行复制，得到更多的病毒粒子，从而实现快速增值。

20、优选的，所述s1中灭活具体步骤如下：

21、将抗原与浓度8-11％的甲醛溶液混合，甲醛溶液的终浓度为0.08-0.12％，然后在37-38℃条件下搅拌灭活24-26h，得到灭活病毒液。

22、通过采用上述技术方较案，利用甲醛溶液和高温度的处理，使病毒被均匀且较为完全的灭活，从而便于制备病毒抗体。

23、优选的，所述s1中制备免疫原具体步骤如下：

24、按重量份取90-96份白油、5-8份司班80、硬脂酸铝1-3份混合搅拌加热至85-95℃，高温杀灭，得到油相；按重量份取95-97份抗原、3-5份灭菌吐温80混匀后，得到水相；油相与水相按体积比2.8-3.2:1混合，搅拌乳化后，分装，得到免疫原。

25、通过采用上述技术方案，白油、司班80作为油相具有较好的乳化作用，能够与水相更好的相容，得到乳状液，稳定免疫原，使得抗原能够均匀分散在乳化液中；并且白油能够促进免疫原被细胞摄取，增强免疫反应的持久性。

26、优选的，所述s2、免疫原以0.4-0.6ml的注射量注射到蛋鸡中，得到一免蛋；在14-16d后，以0.9-1.2ml的注射量注射到蛋鸡中，得到二免蛋；然后等14-16d后，以1.3-1.6ml/只的注射量注射到蛋鸡中，得到三免蛋；然后等28-32d后，以1.8-2.2ml/只的注射量注射到蛋鸡中，得到四免蛋。

27、通过采用上述技术方案，四免蛋经过多次免疫接种，体内产生了大量的抗体，从而提高抗体的抗性和效价。

28、优选的，所述s5沉降剂由6.62-6.68g的pvp、4.12-4.20g的海藻糖和1l水混合制得。

29、通过采用上述技术方案，pvp、海藻糖、柠檬酸、辛酸相配合，通过沉降，去除卵黄液中的酯类物质，提高上清液的纯度，从而使制得的卵黄抗体具有纯度高、效价高的优点。

30、优选的，所述柠檬酸溶液为质量分数28-32％的柠檬酸水溶液。

31、通过采用上述技术方案，限定柠檬酸溶液的质量分数，促进抗体分离，提高抗体稳定性，从而保证的抗性和纯度。

32、综上所述，本技术具有以下有益效果：

33、1、小鹅瘟病毒rd2311b-e21具有强致病性，以此小鹅瘟病毒制备抗体，能够得到高抗性、纯度高的抗体，拓宽抗体的作用范围。