一株产气荚膜梭菌CPB单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一株产气荚膜梭菌cpb单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

1、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens，c.perfringens)也称魏氏梭菌，是一种能够分泌多种致死性外毒素的人畜共患病原，广泛分布于自然界(土壤、污水、饲料、粪便等)，其宿主较为广泛，可感染牛、猪、羊、鸡和人等(fu y,alenezi t,sun xl.clostridiumperfringens-inducednecrotic diseases:an overview[j].immuno,2022,2(2):387-407.)。产气荚膜梭菌可分泌近20余种毒素，其中最主要的致病毒素为α，β，ε和τ毒素及肠毒素(c.perfringens entero-toxin,cpe)和坏死性肠炎b样毒素(necrotic enteritis b-like toxin,netb)。另外，根据其主要产生的毒素可将cp分为7种血清型，分别是a型(α毒素)、b型(α,β和ε毒素)、c型(α和β毒素)、d型(α和ε毒素)、e型(α和τ毒素)、f型(α毒素和cpe)和g型(α毒素和netb)(kiu r,hall lj.an update on the human and animal entericpathogen clostridium perfringens[j].emerg microbes infect,2018,7(1):1-15.)。由于各型cp的宿主和主要致病毒素不同，其导致的疾病也不同，其中a型为最常见类型，主要引起人气性坏疽、食物中毒和家禽坏死性肠炎等；b，c和g型导致绵羊和反刍动物坏死性肠炎等；d和e型引起动物肠毒血症；f型引起人食物中毒和抗生素相关性腹泻等。由于该病主要由致死性外毒素引起，导致该病的发病时间急、病程短且死亡率极高，一旦发病，往往还来不及治疗而发生猝死，因此免疫接种是防控该病的有效方法。目前，预防该菌感染的主要疫苗是通过灭活梭菌培养物上清而制备的天然类毒素疫苗。但该类疫苗有效抗原含量，免疫效果不尽理想。因此，筛选安全、有效、纯净的抗原，用于研制新型产气荚膜梭菌病疫苗，对预防该菌感染具有重要意义。

2、β毒素(cpb)是一种穿孔毒素，通过影响钙离子在神经细胞膜内的分布，进而影响神经组织的功能，破坏正常的神经传导。cpb被认为是产气荚膜梭菌c型和b型菌株的主要毒力因子，并导致几乎所有家畜中的“猝死综合症”，包括羊猝疽和猪、羔羊、小牛等新生动物的坏死性肠炎和肠毒血症，严重危害着畜牧业的健康发展(chen k,ahmed s,sheng yj,suncf,deng cl,ojha sc.diagnostic accuracy of nucleic acid amplification-basedassays for clostridium perfringens-associated diseases:a systematic reviewand meta-analysis[j].journal ofclinical microbiology,2020,58(9):e00363-e00320.)。cpb的致病机理只要是通过与内皮细胞结合，寡聚化并形成穿孔，最终导致肿胀和细胞裂解，从而引起肠道损伤和/或毒素从肠道渗入肠道血液循环，从而引起死亡。cpb是由cpb基因编码，前体蛋白共含有336个氨基酸，其中，第1～27位氨基酸会分泌过程中切除，从而变成有活性的成熟毒素。由于cpb具有不耐热、对体外胰蛋白酶和胃蛋白酶高度敏感以及易于聚合形成多聚等特点，导致从天然产气荚膜梭菌培养物中纯化比较困难。因此，通过外源性表达获得重组cpb是一种很好的途径，但已有的研究发现，由于cpb的n端疏水性，导致外源性表达的重组cpb表达量较低。

3、现阶段预防该病主要以灭活疫苗为主，但其产生抗体滴度会随时间延长而下降(chen k,ahmed s,sheng yj,sun cf,deng cl,ojha sc.diagnostic accuracy ofnucleicacid amplification-based assays for clostridium perfringens-associateddiseases:a systematic review and meta-analysis[j].journal ofclinicalmicrobiology,2020,58(9):e00363-e00320.)。因此，建立灵敏、特异、快速准确的诊断方法对于疫病诊断和抗体水平监测非常重要。检测c.perfringens的方法有细菌分离培养、分子生物学和血清学检测等。细菌分离培养存在操作繁琐、耗时长等缺点；pcr或荧光定量pcr方法存在成本高昂，需特殊设备、对操作人员要求较高等缺点(chen k,ahmed s,shengyj,suncf,deng cl,ojha sc.diagnostic accuracy of nucleic acid amplification-basedassays for clostridium perfringens-associated diseases:a systematic reviewand meta-analysis[j].journal ofclinical microbiology,2020,58(9):e00363-e00320.)，而elisa方法具有敏感性高、特异性强、操作简单等优点，且可监测动物抗体水平。对于牛、羊和家兔等动物通常采用传统的天然毒素灭活疫苗进行免疫预防，但缺少相关的毒素检测和治疗方法。由于天然毒素灭活疫苗抗原成分复杂，有效含量较低，容易引起动物的副反应，导致无法用于犬、猪等动物的预防。已有的研究表明，通过单克隆抗体的制备，能够为某些毒素的治疗和诊断的建立提供基础。单克隆抗体制备的关键是免疫原和包被抗原，但天然毒素的制备、纯化和灭活过程复杂，且具有很高的生物安全隐患。

技术实现思路

1、本发明在选用天然cpb基础上，截取亲水性较强的区域，构建表达重组蛋白，并建立间接elisa检测方法，筛选到一株分泌抗cpb的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并建立cpb的抗体阻断elisa方法，从而为cpb抗体检测提供了替代方法。

2、第一方面，本发明提供一种编码c型产气荚膜梭菌cpb的生物序列，所述生物序列是指c型产气荚膜梭菌的cpb序列中亲水性较高的第30位-第306位氨基酸区域，其氨基酸酸序列如seq id no：1所示。

3、第二方面，本发明提供一种重组蛋白，所述重组蛋白由第一方面所述的生物序列编码：其是由第一方面所述的生物序列编码合成基因片段后构建到载体中，转化至感受态细胞后，由感受态细胞分泌的重组蛋白，命名为rcpbδ。

4、进一步，所述合成基因片段包括对c型产气荚膜梭菌cpb编码基因的密码子优化和添加标签蛋白。

5、更进一步，所述密码子优化是指按大肠杆菌偏好密码子进行优化。

6、进一步，所述添加标签蛋白是指在串联基因的c-末端添加6×his标签蛋白。

7、进一步，所述载体是原核表达载体，优选为pet30a载体。

8、进一步，所述感受态细胞是大肠杆菌，优选为大肠杆菌bl21(de3)。

9、第三方面，本发明提供一种分泌抗产气荚膜梭菌cpb单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为：cgmcc no.46025。

10、第四方面，本发明提供一种第三方面所述杂交瘤细胞株的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：

11、s1.免疫小鼠，利用elisa法测定血清效价，取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合；

12、s2.取s1筛选的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合；

13、s3.利用第二方面所述重组蛋白进行阳性克隆与亚克隆，筛选获得一株能够稳定分泌抗产气荚膜梭菌cpb的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

14、进一步，在步骤s1中，所述免疫原为天然cpb。

15、更进一步，所述天然cpb是指灭活后的产气荚膜梭菌天然cpb。

16、进一步，在步骤s2中，所述骨髓瘤细胞是指sp2/0细胞。

17、进一步，在步骤s2中，所述融合方法为peg介导的化学法。

18、进一步，在步骤s3中，所述阳性克隆筛选是指以第二方面所述重组蛋白rcpbδ为包被抗原的间接elisa方法筛选阳性杂交瘤细胞。

19、进一步，在步骤s3中，所述亚克隆筛选是指用制备的产气荚膜梭菌天然毒素对阳性杂交瘤细胞的细胞上清进行血清中和实验，并进行亚克隆后筛选活性较高的杂交瘤细胞株。

20、第五方面，本发明提供一种抗产气荚膜梭菌cpb抗体，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述单克隆抗体是由第三方面所述杂交瘤细胞株的培养液中获得，或用第三方面所述杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔产生腹水而获得；所述多克隆抗体是以灭活的天然cpb免疫小鼠后，用rcpbδ蛋白接种到小鼠腹腔产生腹水而获得。

21、第六方面，本发明提供一种产气荚膜梭菌cpb的抗体阻断elisa检测方法，所述方法中一抗为第五方面所述的多克隆抗体，所述二抗为hrp标记的单克隆抗体。

22、进一步，所述hrp标记的单克隆抗体是将第五方面所述单克隆抗体的腹水纯化后进行hrp偶联标记的单克隆抗体。

23、进一步，所述cpb多克隆抗体的工作稀释度为1：40，所述单克隆抗体1f11的工作浓度为1:16000。

24、第七方面，本发明提供一种第五方面所述抗体在制备检测产气荚膜梭菌cpb的试剂中的应用。

25、第八方面，本发明提供一种检测产气荚膜梭菌cpb的试剂盒，所述试剂盒包含第五方面所述抗体。

26、进一步，所述试剂盒可以为elisa检测试剂盒、胶体金检测试剂盒、免疫组化试剂盒、免疫荧光试剂盒和/或原位杂交染色试剂盒中的一种或多种。

27、更进一步，所述试剂盒诊断方法包括直接法、间接法、双抗夹心法和/或竞争法中的一种或多种。

28、本发明中的分泌抗cpb的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)提供了生物保藏，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏物名称：鼠源杂交瘤细胞，保藏号：cgmccno.46025，保藏日期为2024年8月01日。

29、有益效果

30、1、本发明首次获得安全、截短疏水区的cpb重组蛋白rcpbδ。

31、2、本发明首次利用天然的cpb作为免疫抗原，利用无毒的rcpbδ作为包被抗原进行单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及后续elisa检测方法的建立；利用以上两种不同形式的毒素来筛选单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法具有以下优点：

32、(1)利用少量的天然cpb作为免疫抗原确保了在最大程度上保持cpb的天然构象；

33、(2)利用纯度为90％以上无毒rcpbδ作为包被抗原进行阳性克隆与亚克隆的筛选以及后续elisa检测方法的建立，既确保包被抗原的纯度，又避免了产气荚膜梭菌天然cpb繁琐的纯化步骤和生物安全隐患。

34、3、本发明首次利用cpb单克隆抗体建立了一种cpb的抗体阻断elisa检测方法，该方法具有样品操作简便、成本低廉、反应快速、特异性强等特点，从而不仅能够为产气荚膜梭菌病的诊断提供参考，也为产气荚膜梭菌抗体阴性动物的筛选和相关疫苗效力检验替代方法的研究提供了基础。