一种同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组合和冻干试剂的制作方法

本发明涉及生物学检测，特别涉及一种同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组合和冻干试剂。

背景技术：

1、支原体肺炎，又称肺炎支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia)，是一种由肺炎支原体引发的下呼吸道感染病症。肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，mp)是目前已知最小的原核致病微生物，无细胞壁，属于柔膜体纲、支原体目、支原体科的一种。高危人群主要包括吸烟者、婴幼儿和免疫力低下的人群。肺炎支原体病原体主要通过飞沫或直接接触传播，引起呼吸道及肺部炎症，严重者可对全身多个脏器造成损害。此病的发病率在空气流动性差，人员接触密集的环境下会增高。肺炎支原体感染可能侵犯上呼吸道或下呼吸道，最常见的临床症状是咳嗽(开始时不排痰，之后痰量从少到中等量)、发热、喉咙痛、头痛、声音嘶哑、胸痛和胸闷等，然而可能有1/5的感染实际上是无症状的。严重的患者可能出现呼吸困难，出现百日咳样痉咳。

2、百日咳是一种由百日咳杆菌引发的急性呼吸道传染病，由呼吸道飞沫传播。病初很像感冒，非典型病例可能无症状、或者仅有轻微咳嗽、有点低热。临床上以阵发性、痉挛性咳嗽、鸡鸣样吸气吼声为特征。若未能及时治疗，患者可能出现长达2个月至3个月的咳嗽症状，故而得名“百日咳”。百日咳杆菌以分离培养为主，标本采用鼻咽试子或咳皿法，根据菌落形态，涂片染色镜检作出初步诊断。确诊可用分离菌与ⅰ相免疫血清作血清玻片凝集或免疫荧光染色。

3、近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。但大多单种试剂仅针对单一的病原体或细菌，在面对一些症状较为相似的疾病往往需要利用不同的检测试剂进行检测，费时费力，且检测成本高。因此，亟需一种可提高肺炎支原体及百日咳杆菌检测效率的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组合和冻干试剂。

2、本发明提供了一种同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组合，所述引物组合包括：

3、(i)肺炎支原体的引物组：引物序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7所示；

4、(ii)百日咳杆菌的引物组：引物序列如seq id no.21、seq id no.22、seq idno.23、seq id no.24、seq id no.25、seq id no.26、seq id no.27所示。

5、进一步的，所述肺炎支原体的引物组与百日咳杆菌的引物组的摩尔比为1：(1～3)，优选为1：(1～2)，更优选为1：1。

6、本发明还提供一种环介导等温扩增体系，所述扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及所述的引物组合。

7、本发明还提供一种冻干试剂，包括所述的引物组合。

8、进一步的，所述冻干试剂还包括反应预混液、冻干保护试剂。

9、进一步的，所述反应预混液包括聚合酶、dntp或酶缓冲液中的任意一种或多种的组合。

10、进一步的，所述冻干保护试剂包括3～10％(w/v)海藻糖，1～5％(w/v)peg20000，0.5～2％(w/v)组氨酸，0.2～3％(w/v)甘露醇，1～2％(w/v)pvp30。

11、本发明还提供所述的引物组合或所述的环介导等温扩增体系或所述的冻干试剂在制备检测肺炎支原体和/或百日咳杆菌的产品中的应用。

12、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

13、1、本发明提供了一种可同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组，引物之间不存在非特异性扩增，特异性好。

14、2、本发明的冻干试剂可同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌，提高呼吸道病原体的检测效率；敏感性高，在检测肺炎支原体时最低检测限为50copies/ml，在检测百日咳杆菌时最低检测限为50copies/ml，试剂特异性强，对近缘及相似症状的病毒检测均为阴性。

技术特征：

1.一种同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述肺炎支原体的引物组与百日咳杆菌的引物组的摩尔比为1：(1～3)。

3.一种环介导等温扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包括：用于扩增的缓冲体系以及权利要求1～2任一项所述的引物组合。

4.一种冻干试剂，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的引物组合。

5.根据权利要求4所述的冻干试剂，其特征在于，所述冻干试剂还包括反应预混液、冻干保护试剂。

6.根据权利要求5所述的冻干试剂，其特征在于，所述反应预混液包括聚合酶、dntp或酶缓冲液中的任意一种或多种的组合。

7.根据权利要求5所述的冻干试剂，其特征在于，所述冻干保护试剂包括3～10％(w/v)海藻糖，1～5％(w/v)peg20000，0.5～2％(w/v)组氨酸，0.2～3％(w/v)甘露醇，1～2％(w/v)pvp30。

8.权利要求1～2任一项所述的引物组合或权利要求3所述的环介导等温扩增体系或权利要求4～7任一项所述的冻干试剂在制备检测肺炎支原体和/或百日咳杆菌的产品中的应用。

技术总结本发明公开了一种同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌的引物组合和冻干试剂。所述引物组合包括：(i)肺炎支原体的引物组：引物序列如SEQ ID NO.2～7所示；(ii)百日咳杆菌的引物组：引物序列如SEQ ID NO.21～27所示。本发明的冻干试剂可同时检测肺炎支原体及百日咳杆菌，提高呼吸道病原体的检测效率；敏感性高，在检测肺炎支原体时最低检测限为50copies/mL，在检测百日咳杆菌时最低检测限为50copies/mL，试剂特异性强，对近缘及相似症状的病毒检测均为阴性。技术研发人员：肖桃英,龙梅,张书萌,施建春,林志铿受保护的技术使用者：厦门为正生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18