基于多肽-发夹DNA偶联物构建的抗污染光电化学DNA传感器的制作方法

本发明涉及h iv检测，具体为基于多肽-发夹dna偶联物构建的抗污染光电化学dna传感器。

背景技术：

1、高灵敏、选择性地检测特定dna序列对癌症早期筛查、突变分析、环境监测、分子诊断等具有重要意义，光电化学生物传感是一种新兴且蓬勃发展的分析检测技术，其工作原理是基于捕获探针与目标物之间特定生物识别事件引发的光电流变化，由于检测信号和激发源之间完全分离，与传统的光学和电化学分析相比，pec检测具有高灵敏度和低背景信号，为了检测更低含量水平的特定dna序列，各种高效的信号放大策略相继被开发，包括杂交链式反应、滚圈扩增、催化发夹组装、聚合酶链式反应和核酸外切酶辅助目标物循环，其中核酸外切酶辅助目标物循环具有不需要额外的标记步骤、辅助物质以及孵育时间短的特性，显示出了其优越性。通常，λ-核酸外切酶(λ-exo)能够识别双链dna并催化5’至3’方向上单核苷酸的逐步水解。这一特性使λ-exo成为dna信号放大的有效工具，尽管如此，光电化学dna生物传感器在进行实际复杂生物样品检测时仍然会存在一些不足。

2、现有技术在使用时存在以下技术问题：

3、问题一，实际生物样品中存在一些潜在的干扰蛋白，这些蛋白质会非特异性的吸附在电极界面，进而对dna生物传感器的分析性能产生影响；

4、问题二，近年来，越来越多的生物传感器利用两性离子肽来达到抗污染的效果，众所周知，两性离子肽具有合成简单、无毒、生物相容好等优点，这使其受到人们的广泛关注，然而目前大多数生物传感器主要涉及两性离子肽与捕获探针的共同锚定，这导致二者之间存在竞争性固定，从而对传感器的抗污染能力和灵敏度产生影响。

5、所以需要一种基于多肽-发夹dna偶联物构建的抗污染光电化学dna传感器来解决上述问题

技术实现思路

1、解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了基于多肽-发夹dna偶联物构建的抗污染光电化学dna传感器，该方法包括：通过将两性离子肽-发夹dna偶联物、复合有机半导体材料和信号放大策略相结合，建立了一个新颖的抗污染型pecdna检测平台，用于准确灵敏地检测人体体液中的目标分析物h iv。

3、技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：基于多肽-发夹dna偶联物构建的抗污染光电化学dna传感器，所述抗污染光电化学dna传感器检测过程包含pda/tcpp/cof-v光电极制备、偶联物lzp-hdna制备、核酸探针pdna-ag i ns2制备、抗污染dna传感器构建以及光电化学测试，所述pda/tcpp/cof-v光电极的制备包括以下步骤，

5、sp1、pda/tcpp/cof-v光电极制备时先将40mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和32mg的1,4-二醛基-2,5-二乙烯基苯溶于20ml乙腈中；

6、sp2、往溶液中加入4ml12m的乙酸作为催化剂；

7、sp3、将sp2中得到的溶液振荡30s并静置72h，利用离心机对溶液进行离心，并将沉淀物收集，之后利用四氢呋喃和乙醇充分洗涤，后续将其置于60℃下真空干燥，从而获得最终产物cof-v；

8、sp4、根据sp3步骤得到cof-v后，称取5mgcof-v粉末分散于10ml去离子水中，超声处理30min后，获得0.5mg/ml分散均匀的cof-v悬浮液，将20μl0.5mg/ml的cof-v悬浮液均匀分散在修饰面积为0.25cm2的i to基底电极上，室温下自然晾干，以此获得cof-v修饰电极；

9、sp5、将5mgtcpp和10mgda溶于5mltr i s-hcl缓冲液(10mm，ph8.5)中，通过超声使tcpp充分溶解；

10、sp6、将20μl该溶液分散在cof-v修饰电极上，保持在黑暗环境中静置30min，使da充分自聚合，最后用去离子水洗涤电极，获得所需的pda/tcpp/cof-v电极。

11、优选的，所述偶联物lzp-hdna的制备方法为将含有300μl40μm的lzp和300μl40μm的hdna溶液混合后置于摇床中，在37℃下保持震荡5min，最终获得浓度为20μm的lzp-hdna偶联物。

12、优选的，所述核酸探针pdna-ag i ns2的制备开始前需要制备水溶性ag i ns2量子点，所述水溶性ag i ns2量子点在制备时先将25ml含有0.1mmmpa、0.4mm i n(no3)3和0.1mmagno3的水溶液置于50ml三颈烧瓶中。

13、优选的，所述置于三颈烧瓶中的水溶液要在快速搅拌下将1.5ml0.2m的na2s溶液迅速加入，将溶液加热至100℃，回流保持2h，使ag i ns2量子点生长充分，最后把获得的量子点4℃进行常温保存。

14、优选的，所述量子点经过酰胺偶联反应合成pdna-ag i ns2核酸探针，所述核酸探针pdna-ag i ns2反应合成时将150μlag i ns2量子点和100μl的10mmedc/nhs溶液混合，室温保持30min，以充分活化ag i ns2量子点表面的羧基，然后将400μl30μm氨基修饰的pdna加入到上述溶液，室温反应2h，最后将所得溶液超滤纯化并用600μltr i s-hcl缓冲液稀释，置于4℃环境中备用。

15、优选的，所述抗污染dna传感器构建过程中将20μl20μm的lzp-hdna偶联物分散至pda/tcpp/cof-v光电极表面，在4℃湿润环境下孵育过夜，通过mi chae l反应将lzp-hdna锚定到光电极表面，然后用tr i s-hcl缓冲液洗涤电极以除去未连接的偶联物，随后将电极与20μl含有10uλ-exo的不同浓度的tdna溶液在37℃下孵育1h，用tr i s-hcl缓冲液洗涤后，将电极与20μl20μm的pdna-ag i ns2核酸探针在37℃下继续孵育1h，tr i s-hcl缓冲液清洗后，所得电极用于后续pec测试。

16、优选的，所述光电化学测试时以制备的传感电极为工作电极，以铂丝为对电极，以饱和ag/agc l电极为参比电极，测试缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，以pbs溶液中的溶解氧作为电子受体。

17、优选的，所述抗污染光电化学dna传感器检测过程中所使用的仪器有透射电子显微镜、扫描电子显微镜、x射线光电子能谱仪、x射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱仪、光电化学工作站、电化学工作站、接触角测量仪、激光共聚焦显微镜和紫外-可见漫反射光谱仪。

18、有益效果

19、本发明提供了基于多肽-发夹dna偶联物构建的抗污染光电化学dna传感器。具备以下有益效果：

20、1、本发明利用点击反应将-n3叠氮基团修饰的线性两性离子肽lzp和3’-二苯并环辛炔dbco修饰的发夹dna(hdna)反应形成lzp-hdna偶联物，该偶联物不仅起到了抗污染的效果，hdna的存在还有利于λ-exo辅助的目标循环放大反应的进行，通过在cof-v电极上修饰内消旋-四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)和聚多巴胺(pda)的复合材料，制备了pda/tcpp/cof-v三元复合光电极，将其充当传感平台的信号转换器并牢固地锚定lzp-hdna偶联物，当tdna和λ-exo存在时，tdna可以和hdna杂交形成双链结构，λ-exo会从5’至3’方向上将其逐步水解，并释放出tdna继续参与到杂交反应中，进而起到目标物循环放大的作用，hdna的未剪切部分会进一步与pdna-ag i ns2信号探针杂交，此时ag i ns2量子点靠近电极，由于带隙不匹配使光电流发生显著降低。

21、2、本发明中通过扫描电子显微镜(sem)进一步证实了合成的共价有机框架(cof-v)具有尺寸均匀、分散性好等优点，sem图像提供了cof-v材料形貌的直接证据，使研究者能够直观地评估材料的尺寸分布、均匀性和分散性。这对于确保后续实验中使用的高质量材料至关重要，cof-v作为光电极的重要组成部分，其形貌和性质直接影响传感器的光电转换效率和灵敏度。尺寸均匀、分散性好的cof-v有助于形成更均匀、更稳定的光电极表面，从而提高传感器的整体性能，由于cof-v的良好形貌和稳定性，它能够为后续修饰的lzp-hdna偶联物提供一个更稳定、更抗污染的界面。这对于在复杂生物环境中保持传感器的灵敏度和准确性至关重要。

22、3、本发明中均匀分布的cof-v有助于λ-exo辅助的目标循环放大反应在光电极表面更有效地进行，这意味着更多的tdna可以被释放并参与循环反应，从而增加光电极上agins2量子点的数量，导致更显著的光电流降低，提高检测的灵敏度，通过sem验证的cof-v材料质量确保了实验结果的可靠性和重复性，这对于科学研究的严谨性和可验证性至关重要。