一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生研究方法与流程

本发明属于生物医学，具体涉及一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生研究方法。

背景技术：

1、神经包括脊髓和周围神经。脊髓(spinal cord)位于脊柱的内且被脊椎保护；是源自脑的中枢神经系统延伸部分。中枢神经系统的细胞依靠复杂的联系来处理传递信息。脊髓主要负责躯干和四肢的反射动作，及传送脑与外周之间的神经信息。周围神经是指脑和脊髓以外的所有神经，包括神经节、神经干、神经丛及神经终末装置；周围神经可根据连于中枢的部位不同分为连于脑的脑神经和连于脊髓的脊神经。神经元胞质(胞浆)的延长部分称为“神经纤维”，也叫“突起”。

2、然而神经按照损伤程度的不同可分为以下几种：神经损伤导致神经功能传导暂时发生障碍，进而导致神经纤维不退行性变，临床表现为运动障碍且无肌萎缩，疼痛持续，不消失，功能可在几天或几周内自行恢复，无后遗症；神经轴索中断神经受钝性损伤或持续压迫，轴索断裂导致远端轴索和髓鞘变性，神经内膜管完整，轴索可沿万鞘管生长至末端，临床表现为神经分布运动、感觉功能丧失、肌萎缩和营养变化的结束，大多情况可自行恢复，在严重情况下，神经内疤痕形成需要神经松解；而神经完全断裂，神经功能完全丧失，需要手术修复才能恢复功能。

3、神经损伤修复后，需对再生神经组织进行可视化检测。传统的再生神经可视化检测方法包括切片观察和基于荧光标记物抗体的检测。其中石蜡切片/冰冻切片(5-25μm薄片)与免疫组织化学荧光，这种方案通常会消耗研究人员大量的精力，且薄片难以重构三维组织，最终效果差强人意，无法完整的反映整个器官维度再生的情况。另一种方法是在整个再生神经组织中组织透明化结合标记预先连接荧光标记物的抗体，由于抗体渗透效率有限，这种方法标记的组织深度低、特异性差，同时，此技术需用到预先连接荧光基团的一抗进行孵育，以避免重复孵育荧光二抗带来的难以洗脱的非特异性荧光，因此限制了抗体标记物的选择，市面上仅几种常用的预偶联抗体可供使用，且价格昂贵。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生研究方法，不仅实现特异性神经轴突荧光信号，而且基于所述荧光信号对再生神经组织实现三维立体成像，可全面准确的评估神经修复手段的有效性。

2、本发明提供了一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生评估方法，包括以下步骤：

3、将荧光蛋白编码基因插入动物基因组nefh基因启动子后，构建得到表达荧光蛋白的动物；

4、对所述表达荧光蛋白的动物进行神经损伤造模，经修复再生，得到神经再生的动物；

5、从所述神经再生的动物中取再生神经组织固定，将再生神经组织透明化处理，得到预处理材料；

6、将所述预处理材料进行生物荧光三维成像，得到再生神经组织三维立体图。

7、优选的，所述表达荧光蛋白的动物的构建方法包括构建表达荧光蛋白的重组donor载体；

8、将所述重组donor载体显微注射至所述受精卵的细胞核中，得到重组受精卵；

9、将所述重组受精卵经胚胎移植至动物中，经饲养和产仔，得到表达荧光蛋白的f0动物；

10、将所述表达荧光蛋白的f0动物经交配和传代，得到表达荧光蛋白的纯合子后代动物。

11、优选的，所述荧光蛋白包括以下至少一种：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。

12、优选的，所述重组donor载体的核苷酸序列如seq id no：1和seq id no：2串联得到。

13、优选的，所述表达荧光蛋白的动物还包括pcr鉴定；

14、所述pcr鉴定用引物包括引物对1和引物对2；

15、所述引物对1包括核苷酸序列如seq id no：3所示的正向引物和核苷酸序列如seqid no：4所示的反向引物；

16、所述和引物对2包括核苷酸序列如seq id no：5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：6所示的反向引物。

17、优选的，所述表达荧光蛋白的动物包括表达荧光蛋白的纯合子动物和/或表达荧光蛋白的杂合子动物。

18、优选的，从所述神经再生的动物中取再生神经组织固定的方法为用多聚甲醛灌注所述动物后，显微境下剥离皮肤、肌肉和骨性组织，取材再生神经置于多聚甲醛中固定。

19、优选的，所述神经包括脊髓和/或坐骨神经。

20、优选的，所述生物荧光三维成像的方法，用激光共聚焦显微境对所述预处理材料进行z轴多层扫描，再用zen软件对扫描结果进行三维重构，得到神经再生图。

21、优选的，所述动物包括小鼠。

22、本发明提供了一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生评估方法，包括以下步骤：将荧光蛋白编码基因插入动物基因组nefh基因启动子后，构建得到表达荧光蛋白的动物；对所述表达荧光蛋白的动物进行神经损伤造模，经恢复生长，得到神经再生的动物；从所述神经再生的动物中取再生神经组织固定，将再生神经组织透明化处理，得到预处理材料；将所述预处理材料进行生物荧光三维成像，得到再生神经组织三维立体图。本发明以荧光蛋白作为报告蛋白插入动物基因组nefh基因启动子后，从而赋予了小鼠优异的神经纤维/轴突特异荧光性能。以神经纤维特异性表达荧光的动物为研究对象进行神经损伤造模，经过神经恢复后，从研究对象中取材再生神经固定并组织透明化，从而保证再生神经组织深度成像。以组织透明化处理的再生神经进行生物荧光三维成像，由于荧光信号特异性在神经轴突处显示，使再生神经组织能够实现立体重构，重现完整的神经再生图景，从而判断再生神经的结构是否恢复如初，从而评估神经恢复方法的有效性。可见，本发明提供的方法，既避免了组织切片带来的繁冗复杂的工作量及免疫组织化学荧光带来的非特异性荧光干扰，又能够实现神经组织的任意部分的再生研究，且不受试剂限制，为再生医学研究者提供更加全面的技术方案，为神经疾病临床治疗提供了良好研究手段。

技术特征：

1.一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述神经再生评估方法，其特征在于，所述表达荧光蛋白的动物的构建方法包括构建表达荧光蛋白的重组donor载体；

3.根据权利要求1或2所述神经再生评估方法，其特征在于，所述荧光蛋白包括以下至少一种：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白和橙色荧光蛋白。

4.根据权利要求3所述神经再生评估方法，其特征在于，所述重组donor载体的核苷酸序列如seq id no:1和seq id no:2串联得到。

5.根据权利要求1或2所述神经再生评估方法，其特征在于，所述表达荧光蛋白的动物还包括pcr鉴定；

6.根据权利要求1所述神经再生评估方法，其特征在于，所述表达荧光蛋白的动物包括表达荧光蛋白的纯合子动物和/或表达荧光蛋白的杂合子动物。

7.根据权利要求1所述神经再生评估方法，其特征在于，从所述神经再生的动物中取再生神经组织固定的方法为用多聚甲醛灌注所述动物后，显微境下剥离皮肤、肌肉和骨性组织，取材再生神经置于多聚甲醛中固定。

8.根据权利要求1所述神经再生评估方法，其特征在于，所述神经包括脊髓和/或坐骨神经。

9.根据权利要求1所述神经再生评估方法，其特征在于，所述生物荧光三维成像的方法，用激光共聚焦显微境对所述预处理材料进行z轴多层扫描，再用zen软件对扫描结果进行三维重构，得到神经再生图。

10.根据权利要求1、2、4、6、7和9中任意一项所述神经再生评估方法，其特征在于，所述动物包括小鼠。

技术总结本发明提供了一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生研究方法，属于生物医学技术领域。一种基于神经纤维特异性荧光的神经再生评估方法，将荧光蛋白编码基因插入动物基因组Nefh基因启动子后，构建得到表达荧光蛋白的动物；对所述表达荧光蛋白的动物进行神经损伤造模，经修复生长，得到神经再生的动物；从所述神经再生的动物中取再生神经组织固定，将再生神经组织透明化处理，将预处理材料进行生物荧光三维成像，得到再生神经组织三维立体图。本发明提供的方法能够特异性的显示神经轴突荧光信号，避免了组织切片带来的繁冗复杂的工作量及免疫组织化学荧光带来的非特异性荧光干扰，为再生医学研究者提供更加全面的实验方案。技术研发人员：孙佳慧,邹剑龙受保护的技术使用者：广东省妇幼保健院（广东省妇产医院、广东省儿童医院）技术研发日：技术公布日：2024/11/18