一种肝母细胞瘤类器官的体外培养方法与流程

本发明涉及类器官构建，尤其涉及一种肝母细胞瘤类器官的体外培养方法。

背景技术：

1、肝母细胞瘤是一种主要发生于儿童的恶性肿瘤，其病理特征和治疗难度使得研究肝母细胞瘤的发病机制和开发有效的治疗方法变得非常重要。目前对肝母细胞瘤的研究方式是二维细胞培养和动物模型，难以完全模拟肝母细胞瘤的复杂病理特征。

2、类器官技术作为一种新兴的三维细胞培养方法，通过在体外培养出与真实器官相似的三维结构和功能，能够模拟真实器官的组织结构、细胞类型和生理功能，如呼吸、排泄、分泌和感知等，因而有助于更好地了解器官的特性和功能，探索其在健康和疾病状态下的变化。并且，类器官可以使用人类来源的细胞培养而成，因此更能准确地反映人体器官对药物的反应和疾病的影响，这不仅使得研究结果更可靠，还减少了对动物的使用，避免了动物实验带来的伦理和道德问题。因此，建立肝母细胞瘤类器官模型，将为肝母细胞瘤的研究提供新的途径，有助于对肝母细胞瘤发病机制以及诊断和治疗手段的研究。

3、现有的构建肝母细胞瘤的方法是从胚肝细胞出发，构建胚肝类器官后，再采用表达特定基因的慢病毒感染，使胚肝类器官转变成肝母细胞瘤(如专利cn116004722a)，存在操作复杂、构建周期长、成本较高、对实验室安全等级要求较高的问题。

技术实现思路

1、为了解决现有的肝母细胞瘤类器官构建方法操作复杂、构建周期长、成本较高、对实验室安全等级要求较高的技术问题，本发明提供了一种肝母细胞瘤类器官的体外培养方法。本发明的方法能够实现肝母细胞瘤类器官的成功构建，且操作较为简单安全，获得类器官所需时间较短，成本较低。

2、本发明的具体技术方案为：

3、一种肝母细胞瘤类器官的体外培养方法，步骤包括：

4、i：制备分散有肝母细胞瘤细胞的凝固胶滴；

5、ii：将包括成纤维细胞生长因子、毛喉素和n-乙酰-l-半胱氨酸在内的生长因子加入到基础培养基内，制成构建培养液；

6、iii：采用构建培养液浸没凝固胶滴，培养得到肝母细胞瘤类器官。

7、本发明中，通过先将肝母细胞瘤细胞制备成凝固胶滴，再采用含有特定组分的构建培养液进行体外培养，成功实现了肝母细胞瘤类器官的构建，并且，由此获得的肝母细胞瘤类器官具有清晰完整的结构形态，在生长过程中能够维持稳定，且能够在该构建培养液中稳定传代。采用本发明的方法构建肝母细胞瘤类器官，操作较为简单，获得类器官所需时间较短。

8、在本发明所使用的构建培养液中，经试验，成纤维细胞生长因子、毛喉素和n-乙酰-l-半胱氨酸对肝母细胞瘤类器官的构建具有重要影响，当缺少其中任何一者时，均会造成该类器官生长发育缓慢，活性差，甚至无法构建得到该类器官。

9、作为优选，步骤ii中，所述构建培养液中，成纤维细胞生长因子的含量为105～320ng/ml，毛喉素的含量为45～55ng/ml，n-乙酰-l-半胱氨酸的含量为1～2mmol/l。

10、作为优选，步骤ii中，所述成纤维细胞生长因子包括重组人成纤维细胞生长因子-10(fgf-10)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)，在构建培养液中的含量分别为100～300ng/ml和5～20ng/ml。

11、作为优选，步骤ii中，所述生长因子还包括：

12、 生长因子名称 在构建培养液中的含量 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 5～10mmol/l l-谷氨酰胺 5～15mmol/l 无血清添加剂 1.5～4.5％vol 表皮生长因子 50～100ng/ml tgf-βi型受体抑制剂 0.3～1.0μmol/l 骨形态发生蛋白拮抗剂 250～500ng/ml wnt信号通路增强剂 100～250ng/ml 胃泌素 10～30ng/ml rho相关蛋白激酶抑制剂 5～15μm

13、进一步地，所述无血清添加剂包括无血清nsc-27添加剂和无血清n-2添加剂，在构建培养液中的含量分别为1～3％vol和0.5～1.5％vol。

14、在构建培养液中，各生长因子对肝母细胞瘤细胞具有不同的影响，本发明中采用由上述各生长因子构成的整体体系，各生长因子之间相互配合，进而实现了肝母细胞瘤类器官的成功构建和稳定传代。

15、虽然现有技术中已经报道过一些构建其他肿瘤类器官的培养液，但培养液配方在不同肿瘤类器官之间并不能通用，并且，细胞内的代谢活动极为复杂，构建培养液中的成分通过影响细胞代谢活动，进而影响类器官的形成，其中所涉及的因素是多方面、相互交叉且错综复杂的，这为研究带来了很大的难度。

16、作为优选，步骤ii中，所述基础培养基为dmem/f12培养基。

17、作为优选，步骤i中，所述凝固胶滴的体积为50～100μl，每个凝固胶滴中含有肝母细胞瘤细胞1.5×105～2.5×105个。

18、作为优选，步骤i中，所述肝母细胞瘤细胞的制备步骤包括：将人肝母细胞肿瘤组织清洗和剪碎后，依次采用胶原酶i和分散酶ii进行消化，从产物中收集得到肝母细胞瘤细胞。

19、进一步地，在依次采用胶原酶i和分散酶ii进行消化后，收集消化产物，裂解其中的红细胞后，滤除成团组织，从滤液中收集得到肝母细胞瘤细胞。

20、作为优选，步骤i包括：将肝母细胞瘤细胞分散到基质胶中，滴加到培养容器内，凝固后，形成分散有肝母细胞瘤细胞的凝固胶滴。

21、作为优选，步骤iii中，每个凝固胶滴使用构建培养液800～1000μl，所述培养的条件如下：环境温度为35～37℃，环境co2浓度为4～6％，每2～3天更换一次构建培养液。

22、作为优选，步骤iii中，在构建得到肝母细胞瘤类器官，进行传代培养，步骤包括：i：将肝母细胞瘤类器官解离成细胞；

23、ii：制备分散有步骤i中所得细胞的凝固胶滴；

24、iii：采用所述构建培养液，浸没步骤ii所得凝固胶滴，进行传代培养。

25、本发明在构建得到肝母细胞瘤类器官后，所使用的构建培养液配方还能够用于后续肝母细胞瘤类器官的稳定传代。

26、作为优选，步骤i中，采用tryple消化液将肝母细胞瘤类器官解离成细胞。

27、作为优选，步骤ii中，所述凝固胶滴内的细胞含量按照1:2～3的传代比例设置。

28、作为优选，步骤iii中，每个凝固胶滴使用构建培养液800～1000μl，所述传代培养的条件如下：环境温度为35～37℃，环境co2浓度为4～6％。

29、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

30、本发明中，通过先将肝母细胞瘤细胞制备成凝固胶滴，再采用特定的构建培养液进行体外培养，实现了肝母细胞瘤类器官的成功构建以及后续的稳定传代，且操作简单安全，耗时较短，成本较低，为肝母细胞瘤发病机制以及诊断和治疗手段的研究提供了能够更好地模拟人体真实器官的模型。