酮还原酶突变体及其在制备(R)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇中的应用的制作方法

本发明属于医药，特别是涉及一种酮还原酶突变体及其在制备(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇中的应用。

背景技术：

1、酮还原酶(ketoreductase，简称kred)，也称为羰基还原酶，是具有催化醛/酮与醇之间可逆氧化还原反应的酶类，需要nad(h)或nadp(h)等辅酶作为氢传递体。在结构上拥有(α/β)8桶装结构以及活性位点asp-tyr-lys-his，大部分表达是以可溶性表达，广泛存在于自然界不同的动物、植物、酵母菌和细菌中。

2、酮还原酶主要分为三类，分别为短链脱氢酶/还原酶(short-chaindehydrogenase/reductases，sdrs)、中链脱氢酶/还原酶(medium-chain dehydrogenases/reductases，mdrs)及醛酮还原酶(aldo-ketoreductases，akrs)；三者的催化功能相似，但在结构及性质上差异较大。

3、使用酮还原酶用于生物转化具有底物特异性强、手性选择性强、转化效率高、不易生成副产物、反应条件温和以及对环境污染小等优势。随着生物技术的快速发展，越来越多的优良性能kred重组酶被挖掘，并应用到医药和化工中间体手性醇的研究中。

4、(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇是具有医用价值的化合物的合成中间体。目前，(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇主要通过化学法来制备，化学合成法需要经过分层、过滤、干燥和分馏等操作，过程复杂，步骤繁琐。从经济和环保的角度出发，不适合工业化大规模生产。

5、因此，本领域亟需一种适合工业大规模生产的、安全性高且操作简单的(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇制备方法。

技术实现思路

1、与传统的化学合成方法相比，生物酶催化法具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点。因此，本发明提供一种酮还原酶突变体及其在制备(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇中的应用，提升底物转化率和产率，同时具备操作简单，安全环保的特点。

2、本发明提供了一种酮还原酶突变体，所述酮还原酶突变体具有(ⅰ)或(ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：

3、(ⅰ)与seq id no:1所示的氨基酸序列相比，具有至少75％同一性的氨基酸序列；

4、(ⅱ)如seq id no:1所示的氨基酸序列的49-169位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而获得的氨基酸序列；

5、其中，所述酮还原酶突变体具有酮还原酶的活性。

6、具体地，所述取代为取代1-9个氨基酸。

7、具体地，所述取代为第49位、第95位、第98位、第101位、第110位、第129位、第167位、第168位或第169位中的任意一个或至少两个的氨基酸位置上具有取代突变。

8、优选地，所述取代为在第49位、第95位、第98位、第101位、第110位、第129位、第167位、第168位、第169位的一个或多个关键位置上发生了突变。优选地，取代是保守性取代。在一些实施方案中，第49位上为野生型的p被取代为非极性氨基酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，优选被取代为异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸；更优选被取代为异亮氨酸。第95位上为野生型的f被取代为不带电荷的极性氨基酸，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸，优选被取代为天冬酰胺、酪氨酸、半胱氨酸，更优选被取代为酪氨酸。第98位上为野生型的p被取代为非极性氨基酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，优选被取代为异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸；更优选被取代为异亮氨酸。第101位上为野生型的h被取代为非极性氨基酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸，优选被取代为甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸；更优选被取代为甲硫氨酸。第110位上为野生型的l被取代为非极性氨基酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸，优选被取代为芳香族非极性氨基酸，如苯丙氨酸、色氨酸；更优选被取代为苯丙氨酸。第129位上为野生型的s被取代为脂肪族非极性氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸或异亮氨酸，优选被取代为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸；更优选被取代为缬氨酸。第167位上为野生型的f被取代为非极性氨基酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，优选被取代为亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸；更优选被取代为亮氨酸。第168位上为野生型的m被取代为其他非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，优选被取代为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；更优选被取代为丙氨酸。第169位上为野生型的r被取代为不带电荷的极性氨基酸，被取代为不带电荷的极性氨基酸，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸，优选被取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸；更优选被取代为谷氨酰胺。

9、具体地，所述取代突变选自下述取代突变中的一种或多种：p49i、f95y、f95m、t98i、h101m、l110y、s129l、f167l、m168a、m168s、m168v和r169q。

10、具体地，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no:2和seq id no:3所示。

11、本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列包括：

12、(1)编码第一方面所述的酮还原酶突变体的核苷酸序列；

13、(2)与(1)中所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

14、具体地，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:6所示。

15、本发明的第三方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体含有第二方面所述的核酸分子，所述核酸构建体为表达框。表达框内除所述核酸分子外，还可含有转录终止序列和启动子。启动子可以是本领域周知的各种启动子，只要其适于在期望的宿主中表达本发明的酮还原酶即可。本领域技术人员可根据所用的宿主细胞选择适当的启动子，构建本发明的表达框以及重组载体。

16、本发明的第四方面，提供一种重组载体，所述重组载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核酸分子，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。重组载体中可含有其它调节元件，包括但不限于增强子、多克隆位点、转录终止子、抗性基因等。可根据不同目的选择具有所需调节元件的相应的载体骨架，将本发明的核酸分子或核酸构建体克隆入所述骨架中，从而构建得到本发明的重组载体。

17、可采用本领域周知的方法制备核酸分子、构建核酸构建体和重组载体，并采用常规的方法表达，从而制备得到本文所述的酮还原酶。

18、本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第四方面所述的重组载体，和/或表达第一方面所述的酮还原酶突变体，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。

19、本发明的第六方面，提供一种酶制剂，所述酶制剂含有第一方面所述的酮还原酶突变体。

20、本发明的第七方面，提供一种酮还原酶在制备(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇中的应用，所述酮还原酶为来源于木兰星菌的酮还原酶或为第一方面所述的酮还原酶突变体，制备(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇的方法包括如下步骤：

21、在助溶剂、葡萄糖和辅酶的存在下，以所述酮还原酶作为催化剂，不对称还原式(i)化合物，反应得到式(ii)或式(iii)化合物；

22、其中，式(i)化合物为式(ii)化合物为式(iii)化合物为

23、具体地，来源于木兰星菌的酮还原酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

24、具体地，所述酮还原酶包括与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的酮还原酶，ncbi登陆号为abb91667。

25、具体地，所述助溶剂选自二甲基亚砜、醇类溶剂和甲苯中的一种或多种的组合，所述反应的反应体系中含有金属离子并使用磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液。所使用的助溶剂应当与水可混溶，以进一步增加底物的溶解性。

26、优选地，所述助溶剂为二甲基亚砜。

27、优选地，所述金属离子为锌离子、锰离子或钴离子；更优选地，所述金属离子为锰离子。

28、优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10-500mm；更优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50-200mm。

29、具体地，所述反应的反应条件为：反应体系的ph为6～10，反应温度为10℃～50℃，反应时间为0.1～96小时。

30、优选地，所述反应的条件为：反应体系的ph为6.5～7.5，反应温度为20℃～45℃，更优选为25℃～32℃，反应时间为12～25小时。

31、具体地，所述催化剂的用量为式(i)化合物重量的0.01-10倍，所述金属离子的用量为式(i)化合物重量的0.01-2％，所述辅酶的用量为式(i)化合物重量的0.01-0.5倍，所述葡萄糖的用量为式(i)化合物重量的0.01-10倍。

32、优选地，所述催化剂的用量为式(i)化合物重量的1-4倍，所述金属离子的用量为式(i)化合物重量的0.05-1％，所述辅酶的用量为式(i)化合物重量的0.05-0.1倍，所述葡萄糖的用量为式(i)化合物重量的1-6倍。

33、优选地，所述辅酶为葡萄糖脱氢酶和nadp。

34、本发明的第八方面，提供一种来源于木兰星菌的酮还原酶或其酶制剂和第一方面所述的酮还原酶突变体在制备手性药物或其中间体中的应用。

35、本发明的主要优点包括：

36、1)本技术公开的酮还原酶突变体，以其作为催化剂，生物酶法不对称还原3-碘-2-环戊烯酮，制备(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇，底物转化率达98.8％，还原产物的ee值大于98％。

37、2)本技术公开的制备(r)-3-碘代环戊-2-烯-1-醇的方法，采用生物酶法，不对称还原3-碘-2-环戊烯酮，反应成本降低，且在本技术提供的反应条件下，反应步骤短，反应条件温和且操作简单，安全性高，对环境的污染小，易于工业化生产，因而本方法具备优异的工业应用前景。