一种识别CV-A6的中和单克隆抗体10G8及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种能够识别柯萨奇病毒a组6型（coxsackievirus a6，cv-a6）的中和单克隆抗体10g8及其应用。

背景技术：

1、引起手足口病的病毒属于小核糖核酸病毒科（picornavirus）肠道病毒属（enteroviruse），为单股正链rna病毒，包括柯萨奇病毒a组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，b组的1、2、3、4、5、6、13型等，肠道病毒71型（human enterovirus 71,ev-a71），埃可病毒（echoviruses）等。早期研究发现ev-a71是手足口病（hand foot and mouth disease，hfmd）的主要致病原, 近年来hfmd肠道病毒病原谱发生了改变，近几年的流行病学资料显示，cv-a6引起的hfmd病例正逐年持续升高，已成为引起hfmd暴发的主要病原体。

2、中和抗体更能反应病毒的抗原性、免疫原性和功能，因此，开发靶向识别cv-a6结构蛋白的中和单克隆抗体对疫苗研发的质控、临床样本的检测和实验室病毒鉴别具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明通过将纯化的灭活cv-a6原液免疫小鼠，然后进行脾脏淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合，并筛选获得杂交瘤细胞10g8，进一步获得单克隆抗体10g8。该单克隆抗体与10g8现有的cv-a6单克隆抗体不同，结合不同的中和位点，其能够识别cv-a6且具有中和活性，可用于cv-a6病毒定量，且反应病毒的含量和功能，对疫苗研发的质控至关重要。

2、本发明目的之一在于提供一种识别cv-a6的中和单克隆抗体10g8，所述中和单克隆抗体10g8的六个cdr区具体如下：

3、（1）重链cdr1的氨基序列如seq id no.1所示：gftlknya；

4、（2）重链cdr2的氨基序列如seq id no.2所示：vssggst；

5、（3）重链cdr3的氨基序列如seq id no.3所示：ereeggyaeawfay；

6、（4）轻链cdr1的氨基序列如seq id no.4所示：qsivqsngnty；

7、（5）轻链cdr2的氨基序列为seq id no.5所示：evs；

8、（6）轻链cdr3的氨基序列为seq id no.6所示：fqgshvpft。

9、进一步的，所述单克隆抗体10g8的重链可变区全长氨基酸如seq id no.7所示，或与seq id no.7所示氨基酸序列有95％以上同源性的氨基酸序列；

10、所述单克隆抗体10g8的轻链可变区全长氨基酸如seq id no.8所示，或与seq idno.8所示氨基酸序列有95％以上同源性的氨基酸序列。

11、在一些具体实施例中，优选的，所述seq id no.7具体为：evklvesggglvkpggslklscaasgftlknyamswvrqtpekrlewvasvssggstyyldsvkgrftvsrdnarnilylqmsslrsedtamyycereeggyaeawfaywgqgtlvtvsa。

12、在一些具体实施例中，优选的，所述seq id no.8具体为：avlmtqtplsltvslgdqasiscrssqsivqsngntylewylqksgqspklllyevsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshvpftfgsgtkleik。

13、进一步的，编码seq id no.7所示氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.9所示；编码seq id no.8所示氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.10所示。

14、在一些具体实施例中，优选的，所述seq id no.9具体为：gaagtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtaaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcaccttaaaaaactatgccatgtcttgggttcgccagactccagagaagaggctggagtgggtcgcatccgttagtagtggtggtagcacctactatttagacagtgtgaagggccgattcaccgtctccagagataatgccaggaacatcctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgaaagagaagaaggcggttacgccgaggcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca。

15、在一些具体实施例中，优选的，所述seq id no.10具体为：gctgttttgatgacccaaactccactctccctgactgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacaaagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaatcaggccagtctccaaagctcctgctttatgaagtttccaaccgcttttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcagggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa。

16、进一步的，所述单克隆抗体10g8为igm型抗体。

17、本发明目的之二在于提供一种编码上述单克隆抗体10g8的核苷酸序列。

18、本发明目的之三在于提供一种表达载体，所述载体含有编码上述的单克隆抗体的核酸分子。

19、本发明目的之四在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的核苷酸序列，或含有上述的表达载体。

20、本发明目的之五在于提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含上述的单克隆抗体或其抗原结合片段及标记物。

21、本发明目的之六在于提供上述的单克隆抗体在制备检测cv-a6试剂或试剂盒中的应用。

22、本发明目的之七在于提供上述的单克隆抗体在制备抑制、预防和治疗cv-a6所引起的疾病的药物中的应用。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

24、（1）本发明提供的单克隆抗体10g8可与偶联物（辣根过氧化酶或异硫氰酸荧光素等）结合用于直接或间接检测、快速诊断；如可用于开发检测由cv-a6感染引起的临床样品的检测试剂或试剂盒，也可用于临床病毒分离株实验室鉴定抗体，同时还可用于制备预防性疫苗生产中间品及产品含cv-a6抗原的定量检测试剂。

25、（2）本发明提供的单克隆抗体10g8体现出优异的被动保护治疗效果，当给注射致死量毒株的小鼠注射不同浓度单克隆抗体10g8后（162.0ng/g小鼠、486.1ng/g小鼠），喂养14天，发现486.1ng/g实验组小鼠存活率达100%，162.0ng/g实验组存活率达70%。