一种肿瘤glycoRNA的提纯筛选方法、系统及设备

本发明属于生物信息学与rna提纯筛选领域，具体涉及一种肿瘤glycorna的提纯筛选方法、系统及设备。

背景技术：

1、糖基化 rna（glycorna）是一类由flynn等人于2021年发现的新型聚糖修饰生物分子，广泛存在于包括人宫颈癌细胞系 hela、293t、人 t 淋巴细胞系 h9 在内的多种类型细胞上，被认为可能在信号转导、免疫反应、肿瘤发生发展中起着重要作用。flynn等人通过一系列提取纯化过程将glycorna分离出来，再分别通过液相色谱质谱联用技术、小rna测序技术对glycorna的两种组成成分：唾液酸聚糖分子、小rna进行了检测鉴定。

2、在检测鉴定来源于细胞的多种glycorna时，将组成glycorna的2种组成成分分别进行检测，并根据检测到的多种小rna、聚糖含量进行排序，但多种小rna、聚糖之间的对应关系是未知的，因此阻碍了对glycorna的进一步的结构和功能研究。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下的技术方案。

2、本发明提供了一种特异性纯化肿瘤glycorna的探针组，所述探针组为：glycornau2探针seq id no:1，glycorna u4探针seq id no:2。

3、本发明提供了一种肿瘤glycorna的提纯筛选方法，所述方法包括：

4、1）对细胞中glycorna进行标记；

5、2）对已标记glycorna的细胞总rna进行提取和纯化，得到纯化总rna；

6、3）对纯化总rna进行小rna纯化，得到纯化小rna；

7、4）对纯化小rna进行链霉素亲和素磁珠纯化，得到粗纯化glycorna；

8、5）对粗纯化glycorna进行glycorna特异性磁珠纯化，洗脱得到纯化的肿瘤glycorna；

9、所述glycorna特异性磁珠由如下方法制备：

10、将磁珠分散液充分混匀，然后移取羧基衍生微珠，磁吸分离磁珠，移去上清液；用rbuffer洗涤磁珠2-3次，磁吸分离磁珠，保留磁珠；移取r buffer溶解氨基oligo，添加到磁珠中，混匀，室温旋转反应；使用r buffer溶解的edc溶液，加入混匀，加入r buffer补足体积，室温下旋转反应，磁吸分离磁珠，用w buffer洗涤磁珠2-3次，得到glycorna特异性磁珠；

11、所述步骤5）中对粗纯化glycorna进行glycorna特异性磁珠纯化，具体包括如下步骤：

12、将链霉素亲和素磁珠纯化后的glycorna样品65℃温育变性，将前面所述的探针组加到变性样品中，37℃杂交30 min，50℃温育变性5min，37℃杂交90~180 min；加入准备好的glycorna特异性磁珠，室温混匀温育结合30 min，收集磁珠并去上清，重复加入washbuffer，37℃摇动洗涤后收集磁珠并去上清。

13、进一步，所述磁珠分散液为含有magnabind™羧基衍生微珠的pbs水性溶液，ph>4.0。

14、进一步，所述氨基oligo为前面所述的特异性纯化肿瘤glycorna的探针组特异性互补的氨基rna探针。

15、进一步，所述r buffer为反应缓冲液，组分为100 mm mes，ph 4.5。

16、进一步，所述w buffer为洗涤缓冲液，组分为1×pbs，ph 7.4。

17、进一步，所述glycorna特异性磁珠使用s buffer保存，保存条件为4℃，磁珠浓度为10mg/ml。

18、进一步，所述s buffer为储存缓冲液，组分为1×pbs，ph7.4，0.05%(w/v) proclin300。

19、进一步，所述羧基衍生微珠与磁珠分散液的比例为10mg：200μl。

20、进一步，氨基oligo、溶解氨基oligo的r buffer、edc溶液、补足体积的r buffer的比例为3od：300μl：150μl：50μl。

21、进一步，所述edc溶液的浓度为100mg/ml。

22、进一步，肿瘤包括实体瘤，具体包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、甲状腺癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤、肾透明细胞癌、肾横纹肌样瘤、肾透明细胞肉瘤、肾原始神经外胚叶瘤、神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、节细胞神经瘤、胚胎型横纹肌肉瘤、腺泡型横纹肌肉瘤、多形型横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、喉癌、副鼻窦癌、舌癌、牙龈癌、颊癌、甲状腺肿瘤、口腔癌、头颈部恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃肠道间质瘤、胸腺瘤、胸腺癌、神经胶质瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、神经纤维瘤、错构瘤、胶质瘤。

23、进一步，所述加入准备好的glycorna特异性磁珠为u2、u4特异性的。

24、进一步，所述洗脱是指洗脱glycorna特异性磁珠上携带的glycorna，具体包括：glycorna特异性磁珠加入 rna elution buffer 混匀后，95℃加热 2 min，收集磁珠并收集上清，再次加入rna elution buffer 混匀后，95℃加热 2 min，收集磁珠并收集上清；将上清加入rna纯化柱中，加binding buffer，10000g，20s离心，弃去废液，加prep buffer洗一次，wash buffer洗2次，空离一次，加入rna free水滴，孵育5min，10000g，20s离心，重复一次，收集洗脱液。

25、进一步，所述对细胞中glycorna进行标记包括步骤：用dmso 将 ac4mannaz（medchemexpress，hy-w728531）溶解成 500 mm，之后用dmso 稀释为 100mm。galnac 和gal 分别用无菌水溶解成 500 mm 和 50mm，用无菌水稀释为100mm和10mm；用终浓度为100μm 的 ac4mannaz (1:1000 稀释，10ml培养基加10μl 100mm 的ac4mannaz)处理10cm培养皿中的u87、ln229或hela 细胞 0和 24h后，收获细胞以提取rna。gal （（sigma，g0750）(10μm，1:1000 稀释)和 galnac（sigma，a2795） (100 μm，1:1000稀释)用作培养基补充剂，并与 ac4mannaz 同时添加。

26、进一步，所述对已标记glycorna的细胞总rna进行提取和纯化包括步骤：通过trizol 法提取总 rna。收集细胞，在trizol中裂解混匀后，样品在37℃下孵育10min，进一步使非共价相互作用变性。之后再加0.2倍体积的氯仿提取rna。涡旋混合，最后在4℃离心，小心地吸取水相，转移到新管中，并与2倍体积的无水乙醇混合；将上述含有总 rna 的溶液加入 zymo rna 纯化浓缩柱（zymo research，1017），10,000 x g 离心 20 s，弃废液，用400 μl rna 制备缓冲液洗1次和 400 μl rna 洗涤缓冲液洗2次对 rna 进行洗涤纯化，再以 10,000 x g 离心 20 s。使用两倍体积的纯水洗脱rna。向 25 μg 纯化 rna 中加入 1μg 蛋白酶 k，37 ℃ 孵育 45 min 后，再次用 zymo柱进行纯化。zymo spin ic和iiicg柱可以结合50-350μg总rna，根据需要纯化的rna的量选择每个实验中的柱。

27、进一步，所述对纯化总rna进行小rna纯化包括步骤：每个15cm培养皿细胞加入2mlrnazol；dna/蛋白质沉淀：充分震荡混匀，每使用1ml rnazol加入0.4ml水，颠倒混匀，静置15min后，12000g，15min离心；mrna沉淀：上清液加入0.4倍体积75%乙醇，颠倒混匀，静置10分钟，12000 g ，8分钟离心；mrna洗涤：上清收集到新管中，沉淀加入0.4ml 75%乙醇洗涤，8000g，2min离心弃上清，洗两次；mrna溶解：使用depc水溶解mrna；mirna沉淀：mrna沉淀得到的上清液中加入0.8倍体积异丙醇，颠倒混匀，静置30分钟，12000g 15分钟离心；mirna洗涤：弃上清，沉淀加入0.4ml，70%异丙醇，8000g，3min，洗涤两次；mirna溶解：使用depc水溶解mirna，并通过zymo纯化柱纯化。

28、进一步，所述对纯化小rna进行链霉素亲和素磁珠纯化包括步骤：链霉亲和素磁珠纯化glycorna：10μl myone c1链霉素亲和素磁珠，用50 ng/ml糖原在500μl biotin washbuffer（10 mm tris hcl ph7.5, 1 mm edta, 100 mm nacl, 0.05% tween-20) ）中，在25℃孵育1h封闭，封闭后4℃，3000rpm离心2min，放于磁力架上，弃上清；500μl biotin washbuffer重旋磁珠，加入生物素化的mirna中，封口膜封口，4℃旋转混合2h，3000rpm离心2min，放于磁力架上，收集上清，后续过纯化柱，用于上样；洗涤珠子以去除未结合的rna：用1ml biotin wash buffer洗涤两次，每次3分钟；洗脱glycorna：将生物素化的rna与磁珠在60μl 0.75m nacl，10 mm edta和10 mm tris-cl（ph 7.4）中（提前配制完成）在22℃孵育5分钟。通过将磁珠重悬于1×体积的5% b-巯基乙醇（bme）溶液中（上一步溶液不弃）并在22℃下孵育5分钟来洗脱rna，3000rpm离心2min，收集上清，通过zymo浓缩纯化柱进行glycorna纯化。

29、本发明提供了一种前面所述的肿瘤glycorna的提纯筛选方法得到的肿瘤glycorna。

30、本发明提供了一种肿瘤glycorna中聚糖的提纯方法，所述方法包括以下步骤：

31、将前面所述的肿瘤glycorna用rna free水稀释，加入pngasef和10×glycobuffer 2，37℃孵育18小时，冷却至室温，使用预处理过的pgc-spe纯化柱2次，然后用5%乙腈/0.1% tfa清洗柱子1次，用1.5 ml、4× 50%乙腈/ 0.1%tfa将聚糖洗脱，立即将样品冷冻在干冰上，然后冻干至干燥，冻干后，溶解于1ml水中，再次干燥，得到纯化的肿瘤glycorna中聚糖。

32、进一步，所述rna free水、pngasef、10× glycobuffer 2的体积比为8:1:1。

33、进一步，所述预处理过的pgc-spe纯化柱的预处理步骤包括：按以下顺序用试剂预处理每个pgc-spe纯化柱:15ml 1m naoh，15ml hplc级水，15ml 30%醋酸，15ml hplc级水，15ml 50%乙腈/0.1%三氟乙酸(tfa)洗柱子3次，15m 5%乙腈/0.1%三氟乙酸洗柱子2次，得到预处理的pgc-spe纯化柱。

34、本发明提供了一种前面所述的提纯方法中使用的肿瘤glycorna中聚糖的提纯试剂盒，所述试剂盒包括：rna free水、pngasef、10× glycobuffer 2、pgc-spe纯化柱、5%乙腈/0.1% tfa、4×50%乙腈/ 0.1%tfa、1m naoh、30%醋酸。

35、本发明提供了一种前面所述的肿瘤glycorna中聚糖的提纯方法得到的肿瘤glycorna聚糖。

36、本发明提供了一种glycorna聚糖分析的系统，所述系统包括，数据获取单元：获得glycorna中聚糖的数据，所述数据为前面所述的肿瘤glycorna聚糖的液相色谱数据；数据处理单元：根据数据获取单元中的数据进行文库鉴定分析；数据输出单元，将数据处理单元的结果进行输出，得到glycorna聚糖的分析结果。

37、在一些实施方案中，glycorna中聚糖分析的系统包括采用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)对glycorna中的聚糖进行鉴定和分析步骤，具体步骤为：将多糖溶液在真空浓缩器中干燥，再溶于纯水中。溶液中加入ch3i和dmso, naoh微螺旋柱进行全甲基化。用氯仿提取甲基化聚糖，用水冲洗数次。然后收集氯仿层，真空浓缩至干燥。lc分离参数设置为:分析柱:360 μm od × 75 μm id, 75 cm;填料:phenomenex jupiter c18, 5 μm, 300 å;隔离柱:360 μm od × 200 μm id, 5 cm;填料:phenomenex jupiter c18, 5μm, 300 å;流动相:缓冲液a为99.9% h2o和0.1% fa的混合物，缓冲液b为99.9% acn和0.1% fa的混合物。串联质谱的参数为:质量分辨率22.5 k，数据依赖采集top 20，自动增益控制目标值1×105，最大离子注入时间200 ms，母离子隔离窗口3 m/z，动态排除50.0 s，阶跃nce为10%。基于lc-ms/ms数据，采用glyseeker软件进行文库鉴定(fdr≤1%)。

38、本发明提供了一种glycorna的三维结构预测的系统，所述系统包括，数据获取单元：获得glycorna的数据，所述数据为前面所述的肿瘤glycorna的测序数据；数据处理单元：根据数据获取单元中的数据进行三维结构预测；数据输出单元，将数据处理单元的结果进行输出，得到glycorna的三维结构。

39、进一步，所述进行三维结构预测包括步骤：使用 rnastructure进行glycorna二级结构预测，然后将二级结构导入到3drna中构建三维结构，再使用动力学软件进行优化。

40、进一步，使用的动力学软件为gromacs 5.0。

41、进一步，所述gromacs 5.0在优化时的模拟条件为：力场 gomacs 54a7，水模型spc，确定模拟体系的温度耦合采用“berendsen thermostat”法，压力耦合采用“manometer”方法，参照压力1.01×105，体系所有方向上采用周期边界条件。

42、进一步，所述gromacs 5.0在优化时采用如下步骤：固定主链在模拟的水溶液环境中优化侧链 5000 步，然后在模拟的水溶液环境中全局优化 5000 步。

43、在一些实施方案中，上述的单元或步骤可通过计算装置实现效果。在一些实施方案中，所述单元或步骤可集中于单个的计算装置上。在一些实施方案中，所述单元或步骤可分布与多个计算装置上，多个计算装置由网络或其他链接方式进行链接。在一些实施方案中，所述计算装置中储存有用于执行上述单元或步骤的程序代码，所述的程序代码储存于存储装置中。在一些实施方案中，所述单元或步骤可分别制备成集成电路，也可组合制成单个的集成电路。

44、本发明提供了一种设备，所述设备包括存储存储器和处理器，所述存储器用于存储程序指令；所述处理器用于调用程序指令，当程序指令被执行时实现前面所述的肿瘤glycorna的提纯筛选方法、或前面所述的肿瘤glycorna中聚糖的提纯方法。

45、进一步，所述存储器包括只读存储器(rom)、相变随机存取存储器(pram)、静态随机存取存储器(sram)、闪速存储器、随机存取存储器(ram)、诸如同步dram(sdram)的动态随机存取存储器(dram)、电可擦除可编程只读存储器(eeprom))、静态存储器、以及其他类型的随机存取存储器、高速缓冲存储器、寄存器、致密盘只读存储器(cd-rom)、数字通用盘(dvd)或其他光存储装置、盒带、其他非暂态介质。

46、进一步，所述处理器包括微处理器、微控制器、图形处理单元（gpu）、专用集成电路（asic）、现场可编程门阵列（fpga）。

47、本发明提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现前面所述的肿瘤glycorna的提纯筛选方法、或前面所述的肿瘤glycorna中聚糖的提纯方法。

48、本发明中使用术语“计算机可读存储介质”应被理解为包括存储一个或多个指令集的单个介质或多个介质(例如，集中式数据库或分布式数据库，和/或相关联的高速缓存和服务器)。术语“计算机可读存储介质”还应被理解为包括能够存储或编码指令集的任何介质，所述指令集用于由机器执行并且致使所述机器完成本发明的方法中的任何一项或多项。术语“计算机可读存储介质”应相应地被理解为包括但不限于固态存储器以及光学介质和磁性介质。

49、本发明提供了前面所述的探针组、前面所述的glycorna的提纯筛选方法、或前面所述的glycorna中聚糖的提纯方法在制备肿瘤glycorna提纯、肿瘤glycorna筛选、肿瘤glycorna聚糖提纯产品中的应用。

50、本发明的优点和有益效果：

51、找到组成胶质瘤细胞glycorna的两种组分：小rna、聚糖之间的对应关系，从而明确其具体构成；利用分子对接模拟方法，预测胶质瘤细胞glycorna的三维结构，为进一步对glycorna的功能研究提供基础。