硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法与流程

本发明属于检测，具体涉及一种硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法。

背景技术：

1、生物胺是一类低分子量的含氮有机碱的总称，主要是由微生物对游离氨基酸的脱羧作用产生。生物胺通常存在于食品中，特别是需要发酵过程的酒类、富含蛋白质的肉和鱼。低浓度的生物胺对消费者的身体健康没有危险，但是过量摄入时会产生毒性反应，如恶心、呕吐、腹泻、呼吸衰竭和心悸。在发酵过程中变化最大的生物胺是组胺和酪胺，其中毒性最强的是组胺。生物胺中的腐胺和尸胺一方面会增强组胺的毒性，另一方面还可与亚硝酸盐反应生成致癌物质亚硝胺，从而对人体的身体健康产生危害。研究表明白酒中的乙醇可对生物胺中的组胺和苯乙胺产生协同作用，会加剧其毒性。国外部分国家已对葡萄酒中组胺做出限量要求，其中要求最严格的是德国规定的不高于2 mg/l。目前我国对酒类中生物胺限量尚无明确规定，但已有文献报道白酒中生物胺含量检出值一般在0.2201~13.027mg/l。因此，生物胺浓度的监测对食品质量和安全至关重要。

2、生物胺的检测方法目前主要有分光光度法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-质谱法。分光光度法的灵敏度太低，不能满足低定量限的要求。高效液相色谱法需用丹磺酰氯进行衍生来增强其在荧光或紫外检测器上的响应，白酒中的多种游离氨基酸也会与衍生试剂反应，对目标物会产生较大基质干扰。液相色谱-质谱联用法不需要对样品进行衍生，但是仪器昂贵，检测成本高，难以在普通实验室推广。气相色谱-串联质谱法具有原理简单，操作便捷，强抗干扰能力，高准确性和灵敏性的特点，非常适用于痕量化合物的分析检测。

3、生物胺类化合物的极性较强、挥发性低、热稳定性差。在气相色谱中可以借助化学衍生反应来增加样品的挥发性，提高检测灵敏度。常用的衍生方法有氯甲酸酯类衍生和丹磺酰氯衍生。氯甲酸酯类试剂有剧毒，对人体和环境都有较大危害；丹磺酰氯衍生前处理操作繁琐，衍生时间长，萃取试剂用量大，因此建立一种绿色环保、快速高效的衍生方法尤为重要。硅烷化衍生是气相分析中常用的衍生方法，其原理是利用三甲基硅烷基来取代样品生物胺分子中的活泼氢原子，减少了氢键束缚，降低了化合物极性，形成的生物胺衍生产物更容易挥发。同时，由于含活泼氢的反应位点数减少，衍生产物的稳定性也得以加强。硅烷化衍生相对于以上两种衍生方法而言，具有操作简便、快捷，对环境更加绿色友好的特点。目前，关于采用硅烷化衍生化结合气相色谱-串联质谱法对白酒中生物胺进行分析的检测方法还未见报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，建立一种快速高效、绿色环保的前处理方法，以稳定同位素内标作为定量方式，结合气相色谱-串联质谱法(gc-ms/ms)的高灵敏性、高准确性对白酒中的苯乙胺、腐胺、组胺、尸胺、酪胺和色胺进行准确分析。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，包括以下步骤：

4、（1）取6种生物胺的标准品，于甲醇中溶解制备混合标准溶液；

5、（2）供试品溶液的制备：

6、1）样品提取：向待检测样品溶液中加入同位素内标工作溶液，加碱调节ph至11~13，加入正丁醇和三氯甲烷混合溶液进行萃取，取萃取液加酸后去除溶剂；

7、2）衍生：步骤1）去除溶剂后的固体加入衍生化试剂进行衍生，衍生后加入正己烷定容，得供试品溶液；

8、（3）检测：将混合标准品溶液和供试品溶液分别进行气相色谱-串联质谱仪检测，混合标准品溶液绘制标准曲线，采用稳定同位素内标法定量，计算供试品溶液中6种生物胺的含量；

9、所述的6种生物胺为苯乙胺、腐胺、组胺、尸胺、酪胺和色胺。

10、进一步地，步骤1）中所述的同位素内标工作溶液的制备方法为取等量的d4-组胺，d4-色胺和d4-苯乙胺加甲醇溶解，配置成浓度为50~150 μg/ml的同位素内标工作溶液。

11、进一步地，步骤1）中待检测样品溶液与同位素内标工作溶液的体积比为40~200:1。

12、进一步地，步骤1）中的正丁醇和三氯甲烷的体积比为1:1。

13、进一步地，步骤2）中所述的衍生化试剂为n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺与1-甲基咪唑的混合物；步骤2）中所述的衍生温度为25~105℃，衍生时间为10~30min。

14、进一步地，步骤2）中所述的衍生化试剂为体积比95:5的n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺和1-甲基咪唑的混合物，步骤2）中所述的衍生温度为75℃，衍生时间为20min。

15、进一步地，萃取液与衍生化试剂的体积比为5:1。

16、进一步地，步骤1）中萃取液与步骤2）中供试品溶液的体积比为1:0.8~1.5。

17、进一步地，气相色谱条件：色谱柱：hp-5ms毛细管柱，30 m×0.25 mm，0.25 μm；进样口温度250 ℃；进样方式：不分流进样；载气为氦气；进样量：1 μl；程序升温：初始温度60℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持9 min，以30 ℃/min升至280 ℃；后运行温度310 ℃，后运行时间：6 min；

18、质谱条件：电子轰击离子源；电离能量：70 ev；离子源温度：300 ℃；传输线温度：280 ℃；采集模式：多反应监测模式（multiple reaction monitoring，mrm）；溶剂延迟为5min。

19、进一步地，步骤1）中所述的碱为氢氧化钠；所述的酸为浓盐酸，萃取液与浓盐酸的体积比为100：1~4。

20、有益效果

21、本发明硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，6种生物胺的线性范围为0.05~5.0 mg/l，相关系数(r2)为0.9970~0.9991，检出限为0.02~0.04 mg/l，定量限为0.05~0.12 mg/l，在添加水平为0.25，2.5，5.0 mg/l时，方法的平均回收率为85.3%~107.8%，相对标准偏差(relative standard deviations, rsds)为1.8%~8.3%；本发明方法简单快速、对环境绿色友好、抗干扰能力强，实现了白酒中6种生物胺的同时测定。

技术特征：

1.一种硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤1）中所述的同位素内标工作溶液的制备方法为取等量的d4-组胺，d4-色胺和d4-苯乙胺加甲醇溶解，配置成浓度为50~150 μg/ml的同位素内标工作溶液。

3.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤1）中待检测样品溶液与同位素内标工作溶液的体积比为40~200:1。

4.根据权利要求1所述的 硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤1）中的正丁醇和三氯甲烷的体积比为1:0.8~1.5。

5.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤2）中所述的衍生化试剂为n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺与1-甲基咪唑的混合物；步骤2）中所述的衍生温度为25~105℃，衍生时间为10~30min。

6.根据权利要求5所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤2）中所述的衍生化试剂为体积比95:5的n-甲基-n-三甲基硅烷七氟丁酰胺和1-甲基咪唑的混合物，步骤2）中所述的衍生温度为75℃，衍生时间为20min。

7.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，萃取液与衍生化试剂的体积比为5:1。

8.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤1）中萃取液与步骤2）中供试品溶液的体积比为1:1。

9.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，

10.根据权利要求1所述的硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，其特征在于，步骤1）中所述的碱为氢氧化钠；所述的酸为浓盐酸，萃取液与浓盐酸的体积比为100：1~4。

技术总结本发明公开了一种硅烷化衍生‑气相色谱‑串联质谱法测定白酒中6种生物胺的方法，属于检测技术领域。本发明向待检测样品溶液中加入同位素内标工作溶液，加碱调节pH至11~13，加入正丁醇和三氯甲烷混合溶液进行萃取，取萃取液加酸后去除溶剂；去除溶剂后的固体加入衍生化试剂进行衍生，衍生后加入正己烷定容，得供试品溶液，前处理方法简单有效，回收率高；将混合标准品溶液和供试品溶液分别进行气相色谱‑串联质谱仪检测，混合标准品溶液绘制标准曲线，采用稳定同位素内标法定量，计算供试品溶液中6种生物胺的含量。本发明方法简单快速、对环境绿色友好、抗干扰能力强，实现了白酒中6种生物胺的同时测定。技术研发人员：李芳芳,梁秀清,陈倩倩,李霞,陈克云,李海霞,田其燕,李洁,王艳丽,刘艳明,王骏,胡梅受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院技术研发日：技术公布日：2025/1/6